飼養密度和硫辛酸對肉雞血清指標、行為及骨骼發育的影響

李文嘉 徐 彬 馬慧慧 魏鳳仙 王琳燚 付 趁 王改利 孫全友 李紹鈺

(河南省農業科學院畜牧獸醫研究所，鄭州450002)

近年來，為了追求高生產效率，節約成本，滿足市場不同需求，肉雞生產逐漸呈現出集約化、快速化、高飼養密度的特點。在集約化、規模化養殖模式下，家禽的生存環境惡劣，使其長期處于應激狀態，嚴重破壞了家禽的健康。然而，當今社會，食品安全和肉品質日益受到重視，養殖動物所處的生產過程也受到密切關注。因此，肉雞養殖業中飼養密度過高給肉雞健康生產造成的負面影響亦越來越突顯。研究表明，當飼養密度超過30 kg/m2時，肉雞釆食減少，同時腳墊損傷和皮膚擦傷的發生率增加[1]。當飼養密度超過35 kg/m2(0.052 m2/只)時，肉雞體重顯著下降[2]，Ericsson等[3]認為其原因是密度過大影響肉雞采食，導致營養素攝入不足所致。在前期研究中我們也發現，當飼養密度達到0.056 m2/只(18只/m2)時，肉雞生長、飼料效率以及免疫性能均顯著低于常規飼養密度組(15只/m2)[4]。田允波[5]研究發現，飼養密度過大不利于肉雞體熱的散發，且高飼養密度條件下，雞群在夏季和秋季猝死率顯著升高[6]。與此同時，飼養密度可直接影響雞只的活動空間，而肉雞的行為與其活動空間大小密切相關。

Van Reenen等[7]研究指出動物行為可反映出其生存環境的舒適程度。當動物機體處于舒適的環境中，會表現出正常的生理行為，當所處環境福利變差，動物則會出現異常行為。因此，肉雞的行為是評價肉雞健康和福利狀態的可靠指標。在企業生產過程中，往往采用高密度、集約化的生產方式，通過把養殖動物限制起來，長時間進行采食行為，導致生存環境惡劣，正常遺傳行為得不到滿足，生理應激壓力隨之而生，就會表現出行為異常。隨著飼養密度的增加，肉雞的運動越來越少，很少進行抓、刨和走動、打鬧等活動。因此，我們推測，高飼養密度會影響肉雞的正常行為，從而引發其腿部疾病，甚至會導致骨骼發育畸形。

α-硫辛酸(alpha-lipoic acid,LA)是一種良好的抗氧化劑，其主要功能是作為線粒體中氧化磷酸化過程中多酶復合物的輔因子，在機體線粒體能量代謝中起著重要作用[8]。同時，LA可以與活性氧結合達到淬滅自由基的效果，也可以與金屬離子進行螯合，阻止體內自由基的形成[9]，還可以使得一些內源性抗氧化劑(維生素C、維生素E、谷胱甘肽等)再生[10]。但是，有關LA對于肉雞飼養密度和骨骼發育方面作用的研究較少。因此，本試驗擬設定不同的飼養密度，并在高飼養密度條件下補飼LA，通過對肉雞生理應激、行為學和骨骼發育等指標進行分析，探討飼養密度和LA對肉雞生理應激、行為和骨骼發育的影響，為確定集約化肉雞飼養密度提供理論依據，為肉雞實現健康養殖的可持續發展提供保障。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗選取1日齡愛拔益加(AA)肉仔雞3 000只，由開封禾豐牧業有限公司提供，按養殖流程正常投喂飼養。并于21日齡時從中挑取健康狀況良好、體重相近的肉仔雞1 530只，隨機分成3個組，對照組為常規飼養密度組(ND組，15只/m2，飼喂基礎飼糧)，試驗組為高飼養密度組(HD組，18只/m2，飼喂基礎飼糧)和高飼養密度+LA組(HD+LA組，18只/m2，在基礎飼糧在添加300 mg/kg LA)，每組6個重復，ND、HD和HD+LA組每個重復肉仔雞數目分別為75、90和90只，試驗期為3周。采用網上平養方式，以重復為單位養殖在長2.46 m、寬2.02 m、高0.60 m的養殖籠內，各重復之間用塑料網隔開。

基礎飼糧采用玉米-豆粕型飼糧，參照我國《雞飼養標準》(NY/T 33—2004)肉仔雞營養需求配制，其組成及營養水平見表1。飼養試驗在河南農科院尉氏養殖基地進行。

1.2 飼養管理

養殖試驗采用網上平養，舍飼顆粒料的方式進行。試驗期間肉仔雞自由采食、飲水，采用23 h人工光照、1 h黑暗處理。按照正常商業飼養管理方式進行常規免疫，保持雞舍良好通風，試驗過程中每天觀察試驗雞只狀況，記錄雞群生長和死亡情況，一旦發現有死亡雞只，及時處理并補充體重相近的肉雞。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(干物質基礎)

續表1項目 Items日齡 Days of age1～2122～42 有效磷 AP0.460.41賴氨酸 Lys1.151.00蛋氨酸 Met0.520.42蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.850.77蘇氨酸 Thr0.880.81色氨酸 Try0.290.27

1.3 測定指標與方法

1.3.1 血清鈣、磷含量及應激指標測定

于42日齡禁食12 h后，每各重復隨機取2只雞，采用翅靜脈采血，3 000 r/min離心15 min，制備血清，分裝后于-80 ℃中保存。測定血清中鈣、磷、甲狀旁腺素(parathyroid hormone,PTH)和皮質酮(corticosterone,CORT)含量以及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、還原型輔酶Ⅱ氧化酶(NADPH-oxidase,NOX)、黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XO)、單胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性。上述指標均采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒測定，測定步驟嚴格按照說明書進行。

1.3.2 行為學指標測定

采用目標取樣法[11]，每個重復隨機用生物染料標記4只目標雞，于試驗最后3 d使用攝像機對目標雞只連續拍攝4 h。將儲存視頻用行為觀察分析系統(Observer XT,Noldus，荷蘭)對目標雞的活動行為(采食、飲水、站立、走動等)和休息行為(休息、趴臥、伸展等)主要行為進行分析，統計每只目標雞各行為發生的頻次和比例。數據記錄整個過程中僅1人觀察，每次觀察各組中的1個重復，統計完后再進行下一個重復。行為頻次定義為單位時間內所發生該行為的次數。行為時間占比定義為該行為發生時間占總行為發生時間的百分比。參照厲秀梅等[12]和朱曉彤等[13]的報道將肉雞行為類別進行分類和定義，具體見表2。

表2 肉雞行為類別及其定義

1.3.3 骨骼發育指標測定

將42日齡采集靜脈血后的雞只屠宰，取左側脛骨、股骨，測定質量、長度、直徑、密度、強度以及礦物鹽、鈣、磷、灰分含量，并計算骨體比(bone weight rate,BWR)。小心剔除骨上的軟骨、脂肪、肌肉組織等附著物，測定脛骨鮮重，計算骨體比。用游標卡尺測量長度和直徑。采用灰化法(GB/T 6438—2007)測定骨灰分含量，乙二胺四乙酸二鈉絡合滴定法(GB/T 6436—2002)測定骨鈣含量，分光光度法(GB/T 6437—2002)測定骨磷含量。采用三點彎曲試驗(TMS-Pro,Food Texture Analyzer,FTC,美國)檢測骨強度。骨密度和礦物鹽含量采用定量計算機斷層掃描儀(Model 922010,Norland Medical Systems Inc.,美國)測定。

1.4 數據統計與分析

試驗數據采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間存在顯著差異時，再進行Duncan氏法進行多重比較，以P<0.05作為檢驗各項數據顯著性的標準。數據以“平均值±標準誤”的形式表示。

2 結果與分析

2.1 飼養密度和LA對肉雞血清鈣、磷含量和應激指標的影響

由表3可知，各組間血清磷、PTH含量以及XO和MAO活性差異不顯著(P>0.05)。HD組血清鈣含量和ALP活性與ND組相比顯著下降(P<0.05)，而HD+LA組血清鈣含量和ALP活性與HD組相比顯著上升(P<0.05)。HD組血清CORT含量以及NOX和MPO活性顯著高于ND組(P<0.05)。與HD組相比，HD+LA組血清CORT含量以及NOX和MPO活性顯著降低(P<0.05)，血清XO和MAO活性雖有下降的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)。

表3 飼養密度和LA對肉雞血清鈣、磷含量及應激指標的影響

2.2 飼養密度和LA對肉雞行為的影響

由表4可知，各組間站立和伸展頻次差異不顯著(P>0.05)。相較于ND組，HD組的行走、梳翅、采食頻次顯著降低(P<0.05)，而飲水頻次顯著升高(P<0.05)。與HD組相比，HD+LA組采食頻次顯著升高(P<0.05)，飲水頻次顯著降低(P<0.05)，梳翅頻次有所上升，但差異不顯著(P>0.05)。

表4 飼養密度和LA對肉雞行為頻次的影響

由表5可知，各組間站立和伸展時間占比差異不顯著(P>0.05)。相較于ND組，HD組行走、梳翅、采食時間占比顯著降低(P<0.05)，而飲水和趴臥時間占比顯著升高(P<0.05)。與HD組相比，HD+LA組采食時間占比顯著升高(P<0.05)，趴臥時間占比顯著下降(P<0.05)，行走、梳翅和飲水時間占比也有所改變，但差異不顯著(P>0.05)。

表5 飼養密度和LA對肉雞行為時間占比的影響

2.3 飼養密度和LA對肉雞骨骼發育的影響

由表6可知，與ND組相比，HD組脛骨直徑、質量、骨體比、密度、強度以及鈣、磷、灰分和礦物鹽含量均顯著降低(P<0.05)，僅脛骨長度無顯著變化(P>0.05)。與HD組相比，HD+LA組脛骨質量以及鈣、磷含量顯著升高(P<0.05)，脛骨密度、骨體比以及礦物鹽和灰分含量有上升趨勢，但差異不顯著(P>0.05)。

表6 飼養密度和LA對肉雞脛骨發育指標的影響

由表7可知，與ND組相比，HD組股骨直徑、質量、密度、強度以及鈣、灰分和礦物鹽含量顯著降低(P<0.05)，股骨磷含量、長度和骨體比無顯著變化(P>0.05)。與HD組相比，HD+LA組股骨密度、強度和鈣含量顯著升高(P<0.05)，股骨直徑、質量以及灰分和礦物鹽含量有上升趨勢，但差異不顯著(P>0.05)。

3 討 論

3.1 飼養密度和LA對肉雞血清指標的影響

飼養密度一直是畜牧業關注的焦點。企業為了追求高生產效率和經濟效益，迫使肉雞飼養密度越來越高。縱然高密度飼養提高了肉雞的產量，但對雞肉品質、疾病發生率等方面造成了許多負面效應，影響了雞群健康，導致經濟效益下降。在本實驗室前期研究中顯示，高飼養密度會導致肉雞生長性能下降，這可能是由于室內養殖環境易受集約化養殖程度的影響，高密度飼養會限制空氣流通，增加空氣中氨的濃度，降低肉雞體熱的正常散失[4]。此外，研究還發現高飼養密度組肉雞平均日攝食率也顯著下降[4]，并推測相較于低飼養密度，在高飼養密度下生長的肉雞更容易出現相互推搡和腿疾，導致肉雞移動困難，攝食率降低[14]。

表7 飼養密度和LA對肉雞股骨發育指標的影響

眾所周知，ALP是成骨細胞成熟的標志酶，是骨形成過程中必要的催化劑，在骨骼鈣化和形成過程中起關鍵作用[20]。本試驗發現，與常規飼養密度相比，高飼養密度顯著降低了血清ALP活性，推測肉雞在高飼養密度條件下，相對活動空間狹小、活動受限等因素促使肉雞發生應激，這可能導致其成骨細胞的活性比例下降，進而影響了骨骼的鈣磷代謝及發育[21]。這與表3中血清鈣含量以及表8中股骨礦物鹽、鈣、磷、灰分含量在HD組顯著下降相吻合。然而，目前有關飼養密度對家禽血清ALP活性影響的研究較少，確切的影響及其機制有待于進一步研究。

在本實驗室前期的研究中，我們發現高飼養密度對肉雞血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性以及丙二醛(MDA)含量有顯著影響[4]。在本試驗中，隨著飼養密度的增加，血清CORT含量呈現升高趨勢，這可能是由于高飼養密度會加劇熱應激(尤其在夏季)的影響，抑制肉雞蒸發散熱，應激強度增強，從而導致血清中CORT含量升高，這與本實驗室之前的研究結論相符合。袁建敏[22]指出，CORT是應激敏感指標，提高飼養密度容易引起肉雞發生應激，引起CORT等血液指標的改變。然而，秦鑫等[23]研究指出，飼養密度對肉雞血清CORT含量沒有顯著影響。造成這種差異的原因可能是由于秦鑫等[23]研究中所設定的飼養密度(10、14只/m2)較低所致。由本試驗數據可知，HD+LA組血清CORT含量相較于HD組顯著降低，這說明在肉雞飼糧中添加LA可以在一定程度上緩解由于飼養密度過高引發的應激反應。

MPO在動物體內可利用過氧化氫和氯離子，產生次氯酸[24]，在細胞內炎癥反應和氧化應激中起到決定性作用[25]。本試驗結果發現，HD組血清MPO活性顯著高于ND組和HD+LA組，這說明高飼養密度會使肉雞發生氧化應激，進而使血清MPO活性升高。同時，有研究指出，當MPO與未激活的MPO集合到甘露糖受體上，使受體與配體之間相互作用，啟動呼吸爆發，可加快氧氣消耗速度，同時激活膜結合的NOX[26]。這也與本試驗中血清NOX活性在HD組較高的結果相一致。因此，推測LA可通過提高抗氧化性能和抑制氧化性能維持氧化還原狀態的穩定，減輕由高飼養密度所造成的氧化應激，進而抑制體內MPO活性的升高。

3.2 飼養密度和LA對肉雞行為的影響

動物的行為是由先天遺傳和后天環境影響復合所形成的，是動物個體與其所處的有機或無機環境維持動態平衡所必需的手段[27]。集約化高密度生產過程中把動物限制在一個較小的活動范圍內，生存環境比較惡劣，正常行為得不到滿足，這種限制動物表達自身天性自由的外界環境刺激會導致其表現出異常行為，影響畜禽體質健康。許多研究指出，行為學是判斷畜禽疾病發生與否的可靠標準[6,28-29]。因此，肉雞行為的變化是評價肉雞健康和福利狀態的有效指標[30]。本試驗研究結果顯示，相較于常規飼養密度，高飼養密度條件下肉雞的行走、梳翅、采食頻次和時間占比顯著降低。這可能是由于肉雞在高飼養密度條件下活動空間受限，福利水平降低，其行走和梳翅行為受到明顯的空間限制所致。張增玉等[31]在對不同飼養密度條件下肉雞行為的研究中發現，隨著飼養密度的增加，肉雞的運動越來越少，很少進行抓、走動、打扮等活動。Buijs等[32]研究指出，增加飼養密度會提高雞群的恐懼性，導致其活動頻率和頻次降低。也有研究發現，增加飼養密度會影響肉雞羽毛梳理，造成羽毛評分變差[33]。此外，Ventura等[34]和Simitzis等[35]研究發現，飼養密度的增加會導致雞群采食行為下降，降低棲息性，提高蹲臥活動，這與本試驗中高飼養密度使得肉雞采食頻次顯著下降以及趴臥時間占比顯著上升的結果相一致。

許多研究指出，高飼養密度不利于肉雞體熱的散發，且飼養密度為18只/m2時，雞群在夏秋季猝死率顯著升高[5-6]。這可能是由于高飼養密度環境下誘發肉雞偏熱應激，肉雞可能采取減少采食和活動來降低自身代謝，并通過增加飲水來緩解高飼養密度帶來的應激，這與本試驗中高飼養密度環境下肉雞飲水頻次和時間占比顯著升高的結果相吻合。Mack等[36]和胡春紅等[37]分別對蛋雞和肉雞進行研究發現，偏熱環境導致蛋雞、肉雞俯臥休息時間顯著增多。

本試驗結果顯示，高飼養密度條件下，飼糧中添加LA對肉雞行走、采食、飲水、梳翅和趴臥等行為有不同程度的改善。然而，就目前研究現狀來看，有關LA對肉雞行為福利方面影響的研究比較罕見。在本實驗室前期的研究中發現高飼養密度會增加肉雞的熱應激，造成其生長、免疫及抗氧化性能下降[4]，而LA的添加可以提高肉雞機體的抗氧化機能，降低體內自由基對細胞膜的損傷，維持細胞膜功能，進而緩解高溫造成的應激[38]。因此，在飼糧中添加LA可有效降低高飼養密度介導的熱應激，對肉雞的行為福利也有一定程度的改善作用。

3.3 飼養密度和LA對肉雞骨骼發育的影響

骨的密度、質量、強度以及灰分和鈣、磷含量等是評價肉雞骨骼發育及其強度變化的重要指標[21]。倪可德[39]指出，骨重占體重的相對比例(骨體比)是反映幼禽鈣、磷需要的敏感指標，是反映骨骼發育狀況的指標之一，其比例高，說明鈣、磷的需求滿足程度高，骨骼的發育較好。本試驗結果顯示，高飼養密度對肉雞骨骼(脛骨和股骨)質量、密度、骨體比、以及鈣、磷、灰分、礦物鹽含量等指標均有不同程度的負面影響。有文獻指出，在高飼養密度條件下，家禽腿部健康易受影響[40]，脛骨軟骨發育不良情況發生率隨飼養密度的增加而增大[41]。Sun等[42]和張璐爽等[43]分別對肉雞和北京鴨進行了研究，結果顯示，高飼養密度會導致脛骨灰分、鈣、磷含量降低；厲秀梅等[12]對肉雞的研究發現，高飼養密度組(18.75只/m2)的脛骨長度和質量顯著低于中、常規飼養密度組。本試驗結果與以上研究結果相符合。

由前文可知，隨著飼養密度的增加，肉雞體內氧化應激越發明顯。有文獻指出，應激過程中產生的自由基會刺激破骨細胞的分化作用，并誘導破骨細胞再次分泌自由基參與骨的再吸收過程，加劇骨基質的降解[49-50]；并且，氧化應激還會抑制成骨細胞的分化和增殖，影響骨基質的形成[51]，這與本試驗中高飼養密度下肉雞骨骼發育異常的結果相一致。白水莉[52]通過試驗得出，高飼養密度和環境應激對肉雞骨骼發育的影響很大，特別是在商業集約化養殖生產中。在本研究中，在高飼養密度肉雞飼糧中添加LA有效改善了肉雞骨骼發育的狀況。這可能是由于LA是一種抗氧化劑，對肉雞機體抗應激，特別是自由基的清除起到重要作用，同LA在三羧酸循環和三大營養物質代謝中也發揮重要作用，它能夠提高骨骼肌細胞對葡萄糖的攝入能力，增強機體細胞內線粒體的生物學功能。有文獻指出，LA能有效改善由氧化應激導致的骨組織內核因子-κB(NF-κB)配體受體致活劑(RANKL)的激活、護骨素(OPG)的抑制以及NF-κB和白細胞介素-6(IL-6)表達的增高，顯著緩解了骨質疏松的程度[53]。朱琳玲[54]研究發現，LA的添加可顯著恢復由高脂飼糧引起的小鼠應激所導致的股骨長度、直徑和羥脯氨酸含量異常現象。由此說明，高飼養密度環境應激下肉雞骨代謝發生紊亂，影響脛骨和股骨的發育，飼糧中添加LA后能有效改善飼養密度應激對肉雞造成的損傷。

4 結 論

① 高飼養密度(18只/m2)會促使肉雞發生慢性應激，導致血清鈣、磷含量降低，行為福利以及骨骼質量下降。

② 飼糧中添加LA可以在一定程度上緩解由于飼養密度過高引發的應激反應，并能有效改善飼養密度應激對肉雞造成的損傷。