玉米赤霉烯酮對青年母豬子宮發育、生長激素分泌及其受體分布與表達的影響

吳峰洋 崔 嘉 楊新宇 陳寶江,2*

(1.河北農業大學動物科技學院，保定071000；2.河北省牛羊胚胎技術創新中心，保定071000)

玉米赤霉烯酮(ZEA)是主要由鐮刀菌菌株產生的，具有類雌激素活性和多種毒性作用的代謝產物，是豬飼糧中最常見的霉菌毒素之一。中國氣候復雜多樣，領土遼闊廣大，谷物在田間生長、收獲加工以及運輸和貯存過程中都容易受到ZEA的污染[1]。王國強[2]對從全國12個省市收集的飼料樣品進行檢測，發現ZEA陽性檢出率為92.59%，ZEA在陽性樣品中的中值為172.2 μg/kg，平均值為332.2 μg/kg，最高值為3 123.8 μg/kg，高于《飼料衛生標準》(GB 13078—2017)的部分限量要求。子宮是重要的繁殖器官，子宮的生長發育及功能狀態直接影響母豬繁殖潛力的發揮[3]。生長激素受體(GHR)是一種單鏈跨膜糖蛋白，可通過與生長激素特異性結合，以自分泌或旁分泌的方式發揮生長調節作用[4]。已有研究表明，ZEA可以促進母豬子宮的發育，但是通過GHR調節子宮發育的報道較少。因此，本試驗以對ZEA較敏感的青年母豬為對象，研究ZEA對子宮發育、生長激素(GH)分泌及GHR分布與表達的影響，為探討ZEA繁殖毒性機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

ZEA購自Triplebond公司(加拿大)，純度保證值≥98%。

1.2 試驗設計及飼糧

選擇胎次和體重[(23.20±0.68) kg]相近的長×大二元青年母豬48頭，隨機分為4組，每組12個重復，每個重復1頭。對照組(CON組)飼喂基礎飼糧，試驗組(T1、T2、T3組)分別飼喂在基礎飼糧中添加200、800、1 600 μg/kg ZEA的試驗飼糧。預試期7 d，正試期40 d。試驗前對豬舍進行清潔和消毒，母豬采用分欄飼養，自由采食和飲水，常規飼養管理。

青年母豬飼喂玉米-豆粕型飼糧，不添加抗生素及脫霉劑。基礎飼糧參照《豬飼養標準》(NY/T 65—2004)進行配制，其組成及營養水平見表1。

飼糧于試驗開始前配制完成，經酶聯免疫吸附測定(ELISA)法檢測，各組飼糧中嘔吐毒素(DON)、伏馬毒素(FB)和黃曲霉毒素B1(AFB1)含量均符合《飼料衛生標準》(GB 13078—2017)的限量要求，ZEA的含量分別為52.37、241.60、825.20和1 634.46 μg/kg。ZEA、DON和AFB1試劑盒購自深圳芬德生物技術有限公司，FB試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 血清及組織指標

于正試期結束后，試驗母豬空腹12 h，然后每組隨機選擇8頭進行前腔靜脈采血，每頭采集15 mL，將血液注入離心管內傾斜靜置，待血凝后3 000 r/min離心10 min，分離血清。每組隨機選取4頭試驗母豬進行屠宰，取子宮組織樣品，血清及部分組織于-80 ℃條件下冷凍保存待測。采用ELISA法測定血清及子宮組織中GH及ZEA含量，試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司，按說明書指示進行操作。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

1.3.2 生長性能及子宮指數

試驗開始時稱量各組母豬的體重獲得初始體重，試驗結束時再次稱量獲得終末體重，并根據試驗天數計算獲得平均日增重(ADG)。統計試驗期間的各組母豬的采食量，計算獲得平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。宰前稱量青年母豬宰前活重，宰后稱量子宮組織重計算器官指數。

子宮指數(g/kg)=子宮鮮重(g)/宰前活重(kg)。

1.3.3 子宮組織形態觀察

取子宮新鮮組織于10%中性甲醛固定液中固定，經脫水，透明，浸蠟，包埋，切片處理后用蘇木素-伊紅染液染色，經脫水，透明，中性樹膠封固后使用顯微攝像系統進行切片觀察和圖像采集。

1.3.4 子宮組織基因相對表達量

根據GenBank中已報道的豬的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、生長激素受體(GHR)、Janus蛋白酪氨酸激酶2(JAK2)和信號轉導與轉錄激活因子3(STAT3)基因序列，和前人文獻中已發表的引物序列，使用Primer 6.0軟件設計相應特異性引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表2)。

表2 實時熒光定量PCR反應引物序列

將子宮樣品取出50～100 mg，提取總RNA，具體操作按Trizol試劑盒(Invitrogen公司)說明進行，用RNA濃度儀(ThermoNanoDrop Lite)檢測RNA濃度。用反轉錄試劑盒(Vazyme公司，R323-01，20 μL反應體系)進行反轉錄，具體操作說明書指示進行。按熒光定量試劑盒(Vazyme公司，Q111-02，20 μL反應體系)具體操作按說明書指示進行。擴增條件為：95 ℃預變性5 min；循環反應95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環；熔解曲線95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。每個樣品作3個重復，目標基因表達情況：mRNA相對表達量=2-△△Ct。

1.3.5 免疫組織化學法檢測

取子宮新鮮組織迅速于4%多聚甲醛固定液中固定，經脫水、修剪、包埋、切片、染色、封片后，使用顯微攝像系統進行切片觀察和圖像采集。

1.3.6 蛋白質印跡法檢測

取子宮組織提取總蛋白，經樣品蛋白質濃度測定(BCA法)、樣品測定、蛋白質變性、上樣、電泳、轉膜、封閉、孵育抗體、顯影、定影后統計結果。

1.4 數據統計分析

使用Excel 2016和SPSS 20.0軟件進行數據統計分析，用one-way ANOVA檢驗各組數據間顯著性差異，用Duncan氏法進行多重比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，0.05

2 結果與分析

2.1 ZEA對青年母豬血清和子宮組織GH含量的影響

由表3可知，各組間血清及子宮組織中GH含量均無顯著差異(P>0.05)。

表3 ZEA對青年母豬血清和子宮組織GH含量的影響

2.2 ZEA對青年母豬子宮組織中ZEA含量的影響

由表4可知，各組間子宮組織中ZEA含量均無顯著差異(P>0.05)，與CON組相比，T2和T3組均升高，分別升高了7.96%和10.40%。

表4 ZEA對青年母豬子宮組織中ZEA含量的影響

2.3 ZEA對青年母豬生長性能及子宮指數的影響

由表5可知，各組間初始體重、終末體重、ADG、ADFI及F/G均無顯著差異(P>0.05)。與

CON組相比，T2組青年母豬的子宮指數顯著升高(P<0.05)，T3組極顯著升高(P<0.01)，分別升高了152%和186%。

表5 ZEA對青年母豬生長性能及子宮指數的影響

2.4 ZEA對青年母豬子宮結構形態的影響

由圖1可知，CON組子宮內膜、肌層和外膜結構較為清晰；子宮內膜上皮細胞矮柱狀，排列較規則，未見明顯變性壞死或增生；子宮內膜固有層基質細胞排列較緊密，多量子宮腺分布，子宮腺結構正常，未見明顯擴張，毛細血管較豐富。與CON組相比，T1組子宮肌層和內膜增厚，固有層近上皮區域細胞排列較稀疏，少量淋巴細胞散在浸潤。T2和T3組子宮肌層和內膜增厚，子宮腺數量增多，毛細血管增多，局部固有層內有細胞灶性浸潤，以淋巴細胞為主，部分上皮細胞變性壞死，見壞死細胞胞質空泡化，胞核固縮。上述結果表明，ZEA可以使子宮肌層和內膜增厚，腺體數量增多，毛細血管增多，使子宮發育異常。ZEA還可以使子宮產生炎性反應(淋巴細胞浸潤)及上皮細胞變性壞死，且隨ZEA劑量增大，損傷作用增強。

2.5 ZEA對青年母豬子宮組織GHR、JAK2、STAT3 mRNA相對表達量的影響

由圖2可知，與CON組相比，T2和T3組子宮GHRmRNA相對表達量以及T2組JAK2 mRNA相對表達量均顯著升高(P<0.05)，STAT3 mRNA相對表達量各組間無顯著差異(P>0.05)。

2.6 ZEA對青年母豬子宮組織GHR免疫陽性分布的影響

由表6可知，各組間母豬子宮組織GHR的平均光密度值沒有顯著差異(P>0.05)，但T2和T3組均高于CON組，其中T3組有升高的趨勢(P=0.08)。

圖3可知，GHR的免疫陽性物質主要分布于子宮的血管、基質細胞、子宮腺、固有層和肌層細胞的細胞質及細胞間質中，陽性細胞呈黃色或棕黃色。ZEA對GHR在青年母豬子宮中的分布與定位無明顯的影響，但各試驗組中隨著子宮肌層和內膜增厚，子宮腺數量增多，毛細血管增多，免疫陽性物質分布進一步增多，免疫陽性強度進一步增大。由此可見，ZEA可以使青年母豬子宮內GHR免疫陽性物質分布增多，免疫陽性強度增大，來促進子宮的發育。

圖CON-1、T1-1、T2-1、T3-1與圖CON-2、T1-2、T2-2、T3-2分別為CON組與各試驗組在100與400倍下獲得的子宮組織視野。圖中綠色箭頭指示淋巴細胞，黃色箭頭指示炎細胞灶性浸潤，紅色箭頭指示上皮細胞壞死。100和400倍下的比例尺分別為：100和10 μm。

2.7 ZEA對青年母豬子宮GHR蛋白表達量的影響

由圖4和圖5可知，各組間青年母豬子宮組織的GHR蛋白表達量沒有顯著差異(P>0.05)，但各試驗組灰度值均高于CON組，其中T2組有升高的趨勢(P=0.09)。

GHR:生長激素受體 growth hormone receptor;JAK2:Janus蛋白酪氨酸激酶2 Janus activated kinase 2;STAT3:信號轉導與轉錄激活因子3 signal transducer and activator of transcriptions 3。

3 討 論

3.1 ZEA對青年母豬血清和子宮GH及ZEA含量的影響

GH是由垂體分泌的肽類激素，具有促進蛋白質合成、影響脂肪和礦物質代謝等生物功能，對子宮的生長發育具有重要的調節作用[8]。研究表明，ZEA及其代謝產物可以影響垂體的功能狀態，繼而改變GH的分泌來影響骨骼和器官的發育。Thomas等[9]報道，玉米赤霉醇可以通過影響羊垂體轉錄因子Pit-1、生長激素釋放激素受體以及GHmRNA的表達來促進GH的分泌。但本試驗中，各組青年母豬血清和子宮組織中GH含量均無顯著差異，說明ZEA處理對青年母豬的GH分泌沒有顯著影響，結果差異可能和試驗動物及試驗材料的差異有關。Olivares等[10]也發現玉米赤霉醇對羔羊血清的GH含量沒有顯著影響。

表6 ZEA對青年母豬子宮GHR平均光密度的影響

圖CON-1、T1-1、T2-1、T3-1與圖CON-2、T1-2、T2-2、T3-2分別為對照組與各試驗組在400倍下獲得的子宮組織的2個視野。圖中ML表示肌層，UG表示子宮腺，LP表示固有層，LE表示腔上皮。圖中比例尺均為40 μm。

圖4 ZEA對青年母豬子宮GHR蛋白表達量的影響

圖5 ZEA對青年母豬子宮GHR蛋白灰度值的影響

ZEA具有類雌激素活性和多種毒性作用，母豬攝入ZEA后經胃腸吸收后，可在子宮、肝臟、腎臟等組織中沉積[11]，發揮毒性作用，ZEA導致的子宮疾病及機能障礙與之有關。本試驗中，各組青年母豬子宮組織中ZEA含量未出現顯著差異，可能和試驗時間相對較短有關。Gajecka等[11]飼喂母豬被ZEA污染的飼糧持續1年，發現子宮組織中ZEA的含量顯著升高。本試驗中，T2和T3組青年母豬子宮ZEA含量較CON組均提高7%以上，可見ZEA沉積量與飼糧添加量有一定的正相關性，這可能是ZEA導致子宮異常發育的原因之一。

3.2 ZEA對青年母豬生長性能及子宮指數和組織形態的影響

本試驗中ZEA對青年母豬的生長性能無顯著影響。Fu等[12]飼喂母豬被ZEA污染的飼糧持續21 d，也發現對ADG、ADFI和F/G均無顯著影響。這可能和消化系統不是ZEA毒性作用的主要靶器官有關。這說明ZEA對生長性能的影響不是造成子宮異常發育的主要原因。

ZEA對子宮組織生長發育的促進作用已有報道，如周敏等[13]在小母豬的飼糧中添加0.5、1.0和1.5 mg/kg ZEA，發現ZEA可使子宮內膜和肌層顯著增厚，腺體數量顯著增多，腺體密度顯著增大，使子宮發育異常。本試驗中，各試驗組青年母豬的子宮指數均高于或顯著高于CON組，且經組織學觀察發現，試驗組青年母豬子宮組織出現肌層和內膜增厚、腺體增多、毛細血管增多等變化。本試驗中，ZEA處理對青年母豬的ADG、ADFI以及F/G均無顯著影響，結合血清和子宮組織中GH含量的變化，說明影響生長性能及調節GH分泌可能不是ZEA促進青年母豬子宮發育的主要作用途徑。ZEA可以通過調控子宮內生長發育相關基因及蛋白的表達來使子宮發育異常，如ZEA可以使母豬子宮內增殖細胞核抗原表達量升高，并激活轉化生長因子-β1(TGF-β1)/Smad蛋白3(Smad3)信號通路[14]。組織學觀察還發現ZEA可以使青年母豬子宮出現炎性反應和上皮細胞變性壞死。這與ZEA能通過c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路引起炎癥反應及損傷，以及ZEA能誘導機體產生過量的活性氧引起氧化應激及損傷有關[15-16]。

3.3 ZEA對青年母豬子宮組織GHR、JAK2、STAT3 mRNA相對表達量的影響

GH在組織和細胞水平發揮作用，需要與靶細胞膜表面的GHR結合使GHR二聚體化，激活JAK2后使GHR胞內結構與及自身酪氨酸殘基磷酸化，進一步激活STAT3，誘導蛋白質因子磷酸化，產生級聯放大效應，將生物信號傳導到細胞內引發生物效應，參與調節子宮組織的生長發育等生理過程[16-17]。組織中GHR的含量及功能影響GH生物效應的發揮，如GHR基因突變可使男童體內的GH的生物效應降低，導致男童身材矮小[18]。JAK2及STAT3是JAK-STAT信號通路中的重要基因，在細胞的生長和增殖過程中發揮重要的調節作用。Feng等[19]報道，GH可通過GHR-JAK2-STAT3途徑促進人子宮內膜腺細胞的增殖，如果使用GHR抑制劑AG490，則GHR、JAK2和STAT3基因表達下調，GH生物效應降低，細胞增殖速率降低。

本試驗中，各試驗組青年母豬子宮組織GHR、JAK2和STAT3 mRNA相對表達量均高于或顯著高于CON組，說明ZEA可能通過上調GHRmRNA相對表達量，提高GH與GHR的結合率，并激活下游JAK-STAT信號通路，使JAK2和SATA3 mRNA相對表達量上調，增強了GH的生物效應。GH可以通過GHR-JAK-STAT途徑促進子宮內膜細胞和子宮內膜腺細胞等細胞的增殖和血管的生成，使子宮指數出現極顯著升高，子宮肌層和內膜增厚，子宮腺和毛細血管數量增多，子宮發育異常[19-20]。Zhou等[21]在斷奶母豬飼糧中添加1 mg/kg的ZEA，也發現子宮指數顯著增大，子宮內膜變厚，GHRmRNA相對表達量顯著升高。

3.4 ZEA對青年母豬子宮組織GHR蛋白陽性分布及表達的影響

在實時熒光定量PCR的基礎上進一步進行了免疫組織化學和Western blot檢測，發現ZEA可以使青年母豬子宮內GHR免疫陽性物質分布增多，免疫陽性強度增大，并且T2組GHR蛋白灰度值有升高的趨勢。這說明ZEA可能通過上調GHR蛋白的表達水平，增強GH的生物作用，來促進子宮的發育。Wathes等[22]報道，GHR可以促進牛子宮發育。而子宮發育加快可能會增加子宮發育不全、早衰、功能異常和子宮肌瘤等疾病的患病風險，降低青年母豬的繁殖潛力[23]。Zhou等[21]在斷奶母豬的飼喂試驗中發現，1 mg/kg的ZEA可以使子宮GHR蛋白表達量顯著升高。戴美玲[6]報道，飼喂斷奶仔豬1.04 mg/kg的ZEA可以促進卵巢發育并使GHRmRNA的表達量及蛋白免疫陽性強度增大，這與本試驗結果一致。

3.5 ZEA對青年母豬繁殖性能的影響

ZEA具有類雌激素活性可以特異性的與雌激素受體結合調控靶基因和蛋白質的轉錄與合成，產生生殖毒性作用，使母豬子宮組織發育異常，子宮細胞凋亡，子宮機能下降，是母豬繁殖性能降低的重要原因之一，持續危害著養豬業的發展[24-26]。本試驗的結果表明，ZEA對GH的分泌無顯著影響，但可以通過調控GHR、JAK2和STAT3 mRNA相對表達和蛋白的表達來增強GH的生物效應，導致子宮異常發育，是ZEA生殖毒性作用的途徑之一。同時，T2和T3組青年母豬子宮還出現淋巴細胞浸潤以及上皮細胞壞死等病理變化。子宮異常發育及出現病理變化，將增加子宮發育不全、早衰、功能異常以及多種疾病的患病風險，導致母豬的繁殖性能降低[23]。如Zhao等[27]在斷奶雌鼠的的飼喂試驗中發現，40 mg/kg的ZEA可以使雌鼠子宮發育異常，子宮機能降低，受精減少，胚胎運輸和植入前發育延遲，胚胎著床中斷，繁殖性能下降。高文博[28]在后備母豬飼糧中添加1 mg/kg的ZEA也發現，子宮發育異常并產生氧化應激損傷。此外，GH通過結合GHR激活下游JAK-STAT信號通路除了參與調節動物的生長發育外，還參與代謝、生殖系統、心血管以及消化系統等多種生理和病理過程的調節[29]。ZEA通過此途徑發揮子宮毒性作用，影響青年母豬的繁殖性能。

4 結 論

ZEA對青年母豬的生長性能以及血清和子宮GH和ZEA的含量均無顯著影響，但是可通過升高GHR、JAK2和STAT3 mRNA相對表達量、增強GHR的免疫陽性、升高蛋白表達量來增強GH的生物效應，使子宮發育異常，導致子宮指數出現極顯著升高，子宮肌層和內膜增厚，子宮腺和毛細血管數量增多。