鴨糞便微生物移植技術

夏戴陽 楊 琳 朱勇文 王文策

(華南農業大學動物科學學院，廣東省動物營養調控重點實驗室，廣州510642)

脊椎動物的腸道中寄居著大量的微生物，它們被統稱為微生物群。腸道微生物群中的基因組中所包含的基因數量可達到宿主自身基因組數量的100倍[1-2]。然而，不僅是數量上的龐大，微生物群在宿主體內也發揮著強大的不可或缺的功能。微生物群可以被看作是一種代謝器官[3]，對宿主營養、腸道發育和生理調節都起到重要的作用。它們可以消化宿主無法消化吸收的成分，產生宿主生長發育所需要的代謝產物[4]。不僅如此，微生物群還決定了宿主免疫系統的發展，影響免疫介導的信號傳遞過程[5]。可以說，正是腸道微生物群將機體的營養、代謝和免疫3個過程緊緊聯結在了一起。

早在1 500年前，東晉的葛洪就用糞便提取物制作成“黃湯”來治療食物中毒和嚴重腹瀉的患者。明代的李時珍也在本草綱目中記載了使用糞便提取物來治療腹瀉、發燒、疼痛、嘔吐和便秘[6]。現如今，糞便微生物移植(FMT)技術不僅在治療艱難梭菌感染方面獲得了巨大成功[7]，對于腸易激綜合征、炎癥性腸病、胰島素抵抗和多發性硬化癥等疾病，FMT技術也表現出很好的療效[8-12]。并且，隨著“肝腸軸”和“腦腸軸”等概念的提出[13-14]，FMT技術應用于代謝病，甚至精神病上的治療也在飛速發展[15-16]。

1 鴨FMT技術的可行性探究

與其他脊椎動物一樣，鴨的胃腸道內也寄居著大量的微生物，在后腸中的數量高達1×1011CFU/g，其中的優勢菌群為厚壁菌和擬桿菌[17]。對于禽類來說，微生物群除了能夠影響機體的代謝功能以外，在機體的免疫功能中也起著獨特的作用。法氏囊是禽類特有的免疫器官。在孵化期間，法氏囊作為禽類腸道的憩室，在禽類孵化后被微生物定植。隨后，這些微生物可以作為抗原促使機體產生抗體，或者誘導機體內產生細胞因子，促進法氏囊B細胞的增殖和成熟[18]。同時，微生物群還可以在腸道內產生黏蛋白來保護腸道，一些禽類的黏蛋白還具有特殊的免疫功能，例如雞黏蛋白可以減輕空腸彎曲桿菌的毒性[19]。此外，FMT技術已經在一些研究中運用于禽類(表1)，這也為鴨糞便微生物移植技術的標準化奠定了基礎。

表1 FMT技術在禽類中的應用

2 鴨FMT供體的選擇

FMT技術中，供體的腸道微生物是治愈受體疾病的關鍵，因此供體的選擇是決定FMT是否成功的重要因素。選擇不合適的供體可能會損害受體腸道菌群的穩定性和耐受性，引起受體腸道排斥反應。此外，由于供體糞便可能攜帶致病性微生物，如若不謹慎選擇供體，FMT過程中可能會導致病原體傳播。供體的選擇包括從表現性狀、行為、抗生素使用史、藥物使用史和疫病史等多方面進行評價，并且在移植前對供體進行血清學檢測和糞便檢測，以監測感染性病原體和其他危險因素。

與鴨傳染病相關的病原微生物主要有以下幾類。1)與鴨傳染性疾病相關的病毒：鴨瘟病毒、鴨肝炎病毒、鴨腸炎病毒、毒性腸炎皰疹病毒、A型流感病毒、鴨細小病毒、鴨副黏病毒(新城疫病毒)；2)與鴨傳染性疾病相關的細菌：禽類多殺性巴氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、煙曲霉菌、黃曲霉菌、彎曲桿菌和單核球增多性李斯特菌；3)與鴨傳染性疾病相關的寄生蟲：艾美球蟲、住白細胞蟲、毛滴蟲、絳蟲、肉孢子蟲和隱孢子蟲[24-33]。

2.1 表觀特征及行為學特征觀察

選為供體的鴨表觀特征與行為應當符合如下條件：1)生長發育良好；2)無不良行為(如啄癖、異食癖)；3)羽毛完整，身體表面無傷口或其他損傷；4)體溫維持在40～42 ℃；5)正常飲水采食；6)糞便正常，未出現病變樣糞便或者便秘；7)無使用抗生素或其他藥物記錄。

此外還需注意的是，作為供體的鴨在收集糞便前的2周內不能接種弱毒疫苗，且不能接觸其他有過疫病史的鴨。

2.2 血清學檢測

病原體可以刺激宿主，并在血清中產生相應的抗體，這使得我們通過抗原-抗體結合反應監測侵入性病原體成為了可能。血清學檢測包括：血清中和試驗、血凝抑制試驗、酶聯免疫吸附測定(ELISA)試驗、瓊脂擴散試驗和補體固定試驗。尤其是ELISA試驗，由于其具有很高的特異性與敏感性，已被廣泛運用于病原體血清學檢測[34-35]。近年來，鴨腺病毒和尼泊爾禽流感病毒都利用血清學檢測進行了研究與風險防控[36-37]。

2.3 糞便檢測

由于糞便中可能攜帶某些傳染性病原體，如禽大腸桿菌、鴨疫里默氏桿菌等致病菌[38-39]。對供體鴨進行糞便檢測可直接降低鴨FMT的傳染風險。從供體鴨的糞便中提取DNA，然后進行PCR擴增，根據標準致病菌的基因序列設計特異性引物，通過相應的擴增產物可判斷糞便中是否存在潛在的病原體[40-41]。

同樣，除了在糞便檢測中篩選致病菌外，還應當關注益生菌的作用。有報道稱，枯草芽孢桿菌可增強鴨的免疫力和抗氧化能力[42]，乳酸桿菌可促進鴨腸道發育，并有助于維持腸道完整性[43]。可以利用16S rDNA測序和宏基因組學的研究方法，根據鴨FMT糞便微生物組成和功能的分析結果，篩選出腸道中具有高豐度“功能微生物”且無致病微生物的最佳供體鴨。

3 鴨FMT技術糞便菌液的制備及保存方法

選取符合FMT條件的供體鴨后，將其與其他鴨隔離，單獨飼養，正常飲水飼喂。在收集糞便的不銹鋼鴨籠下放置牛皮紙，收集供體鴨新鮮糞便。將收集到的糞便樣品保存在無菌的Eppendorf管中，置于冰上，快速轉移到實驗室。如需長時間運輸，則需要置于干冰或液氮中冷凍保存，并在做后續處理時，將樣品置于42 ℃的水浴鍋中溶解。盡量縮短轉移時間，以減少腸道微生物的損耗。

將收集到的糞便樣品轉移到實驗室后，將其與無菌、非抑菌磷酸鹽緩沖液(PBS)按照1∶5的比例混合稀釋，勻漿。將混勻后的懸浮液通過紗布或者0.25 mm孔徑的不銹鋼篩網篩，重復過濾3次，以消除糞便懸浮液中未消化的小顆粒物質[44-45]。之后將濾液轉移到無菌的離心管中，置入離心機中，1 000 r/min離心5 min。用移液槍小心吸取上清液，制成糞便菌液。

制作好的糞便菌液可即刻用于受體，進行糞便微生物移植操作。如需長期保存，則需要在菌液中加入10%無菌甘油，混合完全后置于-80 ℃環境保存，冷凍樣品需在6個月內使用完畢。由于腸道微生物以厭氧菌為主，在制作糞便菌液過程中，應盡量縮短糞便暴露在空氣中的時間。所有操作均在室溫下進行，優先在厭氧培養箱中操作，所有試驗儀器設備均要求做無菌處理。

4 鴨FMT技術糞便微生物的移植

在人類醫學中，將糞便微生物轉入受體體內方式有很多種，包括從上消化道(口服)、中消化道(內窺鏡、鼻胃管、鼻空腸和鼻十二指腸)和下消化道(結腸鏡檢查和灌腸)給藥[46-47]。對于鴨來說，由于其腸道短、代謝快，灌胃糞便菌液是最佳給藥方式[48]。灌胃過程為：取出受體鴨并稱重；在注射器前嵌套灌胃塑膠軟管，按10 mL/kg劑量吸取糞便菌液，反復吹打幾次，排凈灌胃管內氣泡；將受體鴨保定，沿著受體鴨食管向腹部左側進管，注射糞便菌液(過程要迅速，防止受體鴨產生應激反應或嘔吐反應)。每次灌胃都需要替換潔凈無菌的注射器和灌胃塑膠軟管。

5 小 結

基于人類醫學和鴨養殖業的經驗，本文探討了關于鴨FMT技術標準化程序的制定，包括供體鴨的選擇、糞便菌液的制備保存和糞便菌液的移植，同時也為鴨養殖生產提供了一個全新的思路：FMT是一種技術手段，它不僅可以用于治療疾病，也可以與動物的疾病防控，甚至與提高動物的生產性能聯系在一起。通過對鴨FMT技術的標準化，在無抗養殖的大環境下改善鴨的腸道健康，可推進整個畜牧行業向綠色養殖過渡。目前，FMT技術已在豬養殖業有所應用，主要以初生仔豬為受體，進行糞菌移植，以達到降低腹瀉率、提高生產性能的目的。由于豬為哺乳動物，進行FMT操作需要在仔豬斷奶后進行，并且仔豬體型較大，灌胃或灌腸時需多人操作，糞便菌液制作量大，灌胃耗時長。相較而言，鴨FMT技術具有易于操作、無生長階段限制以及糞便菌液制作方便等優勢。

目前，我們對于腸道微生物的了解還不夠全面，對于微生物之間的相互作用還未探明，微生物群的具體作用機制和通路還有待深入探索。但隨著高通量研究方法包括宏基因組學、元轉錄組學和代謝組學的日益發展，宿主健康與腸道菌群組成和功能之間的關系將會逐漸得到揭示。FMT技術的標準化和普及、糞便菌液干粉化處理以及鴨腸道微生物庫的建立只是腸道微生物應用于水禽生產的初步探索，未來將會有更多更精準的FMT治療方案，人們對于健康機體的微生物區系也將會有更清楚的認識。屆時，對于致病微生物將不再需要大劑量的抗生素進行“不分敵我”的殺滅，而是只需要使用健康的菌群進行定植，即可達到治愈改良效果。相信在不久的將來，通過腸道微生物介導以改善動物機體健康將會成為現實。