骨內壓干預對DH豚鼠退變脛股關節軟骨保護作用及軟骨內2型膠原與MMP13表達的影響*

王 碩，馬劍雄，杜育任，黃洪超，焦尚起，史建國，馬信龍△

(1.中國人民解放軍天津康復療養中心/原解放軍464醫院骨科，天津 300381；2.天津醫院骨科研究所 300050)

退行性膝骨關節炎是常見關節退變性疾病，約80%的65歲以上人群患有退行性膝骨關節炎，因關節軟骨退變，最終可導致關節功能喪失[1-2]。退行性膝骨關節炎的主要危險因素是年齡，隨著人口的老齡化，其發病率迅速升高，帶來嚴重的社會經濟問題。生理情況下，軟骨細胞及軟骨基質維持著關節軟骨的穩態；在退行性膝骨關節炎中，關節軟骨中的蛋白聚糖被切割，2型膠原也被降解[3-4]。膠原蛋白是一種三螺旋蛋白，對大多數蛋白酶具有抗性，但可被基質金屬蛋白酶13(MMP13)有效識別和降解。MMP13在一個獨特的位點催化2型膠原的水解，從而產生3/4和1/4長度的多肽產物[5-6]。MMP13屬于基質金屬蛋白酶(MMPs)家族，是參與細胞外基質(ECM)重塑的鋅依賴性內肽酶。骨內高壓被認為與退行性膝骨關節炎疼痛相關，主要指骨內血流動力學異常[7]。研究發現，髕骨軟骨軟化存在膝前痛的患者，其髕骨內壓升高。通過穿刺減壓或截骨可迅速降低骨內壓，緩解疼痛[8]。本研究擬探討骨內壓干預對Dunkin Hartley(DH)豚鼠退變脛股關節軟骨的保護作用，以及對關節軟骨內2型膠原、MMP13表達的影響，為退變性關節炎的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物喂養及分組

雄性DH豚鼠6、9、12、18月齡各10只(n=40)，由重慶醫科大學動物實驗中心提供，動物合格證號：SYXK(渝)2019-0011，豚鼠生產許可證號：SYXK(渝)2016-0018。其中，非減壓組各月齡5只，減壓組各月齡5只。動物飼養環境：溫度(22±2)℃，濕度(55±3)%，12 h光照-黑暗循環(光照時間6：00-18：00)。

1.1.2實驗儀器與試劑

PT-30陶瓷厚膜壓力傳感器(美國DJ公司)，TRIzol?試劑(美國ThermoFisher Scientific公司)，mi Script Ⅱ RT試劑盒(德國Qiagen GmbH公司)，SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(美國Clontech Laboratories公司)，ABI 7500型RT-qPCR儀(美國ThermoFisher Scientific公司)，2型膠原、MMP13兔多克隆一抗(美國Sigma公司)，MaxVision TM HRP-聚合物抗鼠/兔IHC試劑盒(美國MaxVision公司)，3，3′-二氨基聯苯胺四鹽酸鹽(DAB，上海碧云天生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1各組DH豚鼠膝關節骨內壓測定

非減壓組適應性飼養結束后測定骨內壓，減壓組減壓術后測定骨內壓。操作方法：膝關節內側縱形切口，近端起自股骨內髁，遠端至脛骨內髁，逐層切開皮膚、皮下組織，保護膝內側血管及神經，顯露膝內側副韌帶，選擇膝關節內側副韌帶股骨遠端、脛骨近端附著點為測壓穿刺點，逐級穿刺針由內側向外側穿刺至抵住對側骨皮質，測壓孔直徑為?0.7 mm[9]，連接PT-30陶瓷厚膜壓力傳感器，股骨遠端、脛骨近端測壓完畢后，拔除穿刺針，逐層嚴密縫合傷口。

1.2.2減壓術實施

選擇膝關節內側副韌帶股骨遠端、脛骨近端附著點為穿刺減壓點，使用直徑?1.5 mm、?2.0 mm麻花鉆頭，由內側向外側穿刺擴孔減壓，至抵住對側骨皮質，減壓孔直徑為?2.0 mm，減壓后分別于術后4周測壓。

1.2.3脛股關節軟骨2型膠原、MMP13 mRNA表達的測定

實驗期間無DH豚鼠死亡，實驗結束后(實驗周期為4周)，立刻處死DH豚鼠，獲取脛股關節軟骨；應用TRIzol?分離總RNA，mi Script Ⅱ RT試劑盒逆轉錄為cDNA，應用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒檢測mRNA表達水平。反應系統以20 μL的體積進行，熱循環條件如下：95 ℃持續10 min，然后40個循環(95 ℃持續10 s，60 ℃持續2 min，72 ℃持續2 min，在72 ℃下延長10 min)。通過實時熒光定量PCR(RT-qPCR)分析目標基因和對照。2型膠原引物正向：5′-ATG ACA GCG GCA CCT ACC T-3′，反向：5′-CCT ATT GTC CCT CGT GCG-3′；MMP13引物正向：5′-ACA CTC CAG CTG GGA TAT AAT ACA ACC TGC TA-3′，反向：5′-CTC AAC TGG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TCA GTT GAG CAC TTA GC-3′；GAPDH引物正向：5′-TGT TCG TCA TGG GTG TGA GA-3′，反向：5′-ATG GCA TGG ACT GTG GTC AT-3′；U6引物正向：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，反向：5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。使用Livak法分析數據，將目的mRNA表達水平相對于GAPDH/U6標準化。所有數據表示為3個獨立實驗的均值。

1.2.4脛股關節軟骨2型膠原、MMP13表達的測定

將脫鈣后石蠟包埋的5 μm脛股關節組織切片置于75 ℃烤箱中6 h，逐級脫蠟至水，3%過氧化氫(H2O2)去離子水室溫孵育10 min以滅活內源性過氧化物酶活性，之后于0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)行抗原熱修復。將組織切片分別與抗2型膠原、MMP13的一抗以1∶400的稀釋度孵育過夜，之后用MaxVision TM HRP-聚合物抗鼠/兔IHC試劑盒和DAB處理，用0.5%蘇木素行輕度核復染。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 減壓與非減壓組DH豚鼠脛股關節骨內壓比較

6、9、12、18月齡減壓組DH豚鼠脛股關節骨內壓均明顯低于非減壓組(P<0.05)；且隨月齡增長，兩組骨內壓均先增加后降低，至12月齡時骨內壓達到峰值，兩組組內不同月齡組脛股關節骨內壓存在明顯差異(股骨側：F=12.548、9.875，P<0.001；脛骨側：F=11.687、9.667，P<0.001)，見表1。

表1 兩組DH豚鼠脛股關節骨內壓比較

2.2 減壓與非減壓組DH豚鼠脛股關節形態學改變

隨時間推移，6、9、12、18月齡豚鼠脛股關節均表現出軟骨退變(脛骨近端內外側緣可見明顯流水樣軟骨樣或骨樣增生、明顯軟骨缺損等)，但與非減壓組相比，減壓組退變程度更輕。骨內減壓對于退變程度不同的關節軟骨均展現了明顯的保護作用，見圖1。

A、C、E、G：6、9、12、18月齡非減壓組DH豚鼠脛股關節；B、D、F、H：6、9、12、18月齡減壓組DH豚鼠脛股關節。

2.3 減壓與非減壓組DH豚鼠脛股關節2型膠原mRNA水平比較

減壓組6、9、12、18月齡DH豚鼠脛股關節2型膠原mRNA水平均明顯高于非減壓組(P<0.05)；隨月齡增長，兩組2型膠原mRNA水平逐漸降低，至18月齡時，2型膠原mRNA水平達到最低值，兩組組內不同月齡DH豚鼠2型膠原mRNA水平存在明顯差異(股骨側：F=10.657、8.997，P<0.001；脛骨側：F=8.635、6.694，P<0.001)，見表2。

表2 兩組DH豚鼠脛股關節2型膠原mRNA水平比較

2.4 減壓與非減壓組DH豚鼠脛股關節MMP13 mRNA水平比較

減壓組6、9、12、18月齡DH豚鼠脛股關節MMP13 mRNA水平均明顯低于非減壓組(P<0.05)；隨月齡增長，兩組MMP13 mRNA水平逐漸升高，至18月齡時MMP13 mRNA水平達到峰值，兩組組內不同月齡DH豚鼠MMP13 mRNA水平存在明顯差異(股骨側：F=9.658、12.698，P<0.001；脛骨側：F=13.547、10.258，P<0.001)，見表3。

表3 兩組DH豚鼠脛股關節MMP13 mRNA水平比較

2.5 減壓與非減壓組DH豚鼠脛股關節2型膠原表達水平比較

減壓組6、9、12、18月齡DH豚鼠脛股關節2型膠原表達水平均明顯高于非減壓組(P<0.05)；隨月齡增長，兩組2型膠原表達水平逐漸降低，至18月齡時，2型膠原表達水平達到最低值，兩組組內不同月齡DH豚鼠2型膠原表達水平存在明顯差異(股骨側：F=6.998、12.547，P<0.001；脛骨側：F=8.992、10.548，P<0.001)，見表4、圖2～3。

A、C、E、G：6、9、12、18月齡非減壓組DH豚鼠脛股關節股骨側；B、D、F、H：6、9、12、18月齡減壓組DH豚鼠脛股關節股骨側。

表4 兩組DH豚鼠脛股關節2型膠原表達水平比較

2.6 減壓與非減壓組DH豚鼠脛股關節MMP13表達水平比較

減壓組6、9、12、18月齡DH豚鼠脛股關節MMP13表達水平均明顯低于非減壓組(P<0.05)；隨月齡增長，兩組MMP13表達水平逐漸升高，至18月齡時，MMP13表達水平達到峰值，兩組組內不同月齡DH豚鼠MMP13表達水平存在明顯差異(股骨側：F=6.878、10.369，P<0.001；脛骨側：F=10.636、9.635，P<0.001)，見表5、圖4～5。

A、C、E、G：6、9、12、18月齡非減壓組DH豚鼠脛股關節脛骨側；B、D、F、H：6、9、12、18月齡減壓組DH豚鼠脛股關節脛骨側。

A、C、E、G：6、9、12、18月齡非減壓組DH豚鼠脛股關節股骨側；B、D、F、H：6、9、12、18月齡減壓組DH豚鼠脛股關節股骨側。

表5 兩組DH豚鼠脛股關節MMP13表達水平比較

A、C、E、G：6、9、12、18月齡非減壓組DH豚鼠脛股關節脛骨側；B、D、F、H：6、9、12、18月齡減壓組DH豚鼠脛股關節脛骨側。

3 討 論

退行性膝骨關節炎的主要特征是軟骨損傷、軟骨下骨重塑、關節間隙變窄、滑膜炎及關節邊緣骨贅形成。無論最初的觸發因素如何，關節軟骨損傷都是退行性膝骨關節炎的主要病理改變。目前的臨床治療主要包括非甾體類抗炎藥(NSAIDs)、關節內注射透明質酸結合物，以及最終的關節置換術等。關節軟骨營養補充劑如葡萄糖胺和硫酸軟骨素的功效尚存爭議，且目前尚無可延遲或逆轉與疾病相關的軟骨逐漸破壞的治療方法。由于這些方法不能保護關節軟骨或延緩疾病的發展，從而使該病發展為不可逆的ECM喪失和慢性殘疾，因此，開發新型治療手段對保護退行性膝骨關節炎中的關節軟骨具有重要意義[10]。

骨內減壓的理論基礎為病變局部的骨內壓增高及血液循環瘀滯，因其可有效緩解退行性膝骨關節炎的靜息痛，臨床上已應用于股骨頭壞死、頑固性跟痛癥、凍結肩等疾病的除痛治療[11]。DH豚鼠膝關節軟骨病變最早可見于3月齡，表現為內側脛骨平臺軟骨細胞局灶性死亡；6月齡表現為中層甚至深層軟骨細胞出現克隆性增殖；9月齡表現為脛骨骨贅、軟骨下骨硬化；12月齡表現為整個內側間室軟骨退變。隨月齡增長，軟骨下骨板及松質骨小梁的厚度及密度逐漸增加，彈性逐漸降低，其髓內空間存在逐漸降低的趨勢。在灌注量和流出量不變的情況下，骨內壓會逐漸升高，當空間減小超過其對灌注量的緩沖范圍時，升高的幅度會顯著增加；若軟骨下骨增生或塌陷，使髓腔容積進一步減少到某一程度時，骨內血流灌注亦可發生障礙，致使骨內壓降低。本研究結果顯示，減壓組6、9、12、18月齡DH豚鼠脛股關節骨內壓均明顯低于非減壓組；隨月齡增長，非減壓組、減壓組均呈現出先增加后降低的趨勢，在12月齡時，骨內壓達到峰值。結合DH豚鼠脛股關節形態學改變的大體結果，6、9、12、18月齡DH豚鼠脛股關節均表現了軟骨退變，如脛骨近端內外側邊緣可見明顯流水樣軟骨樣或骨樣增生、明顯軟骨缺損等，但與非減壓組相比，減壓組退變程度更輕。骨內減壓對于退變程度不同的脛股關節軟骨均展現了明顯的保護作用。這與上述討論一致，同時說明，骨內減壓能夠通過明顯降低DH豚鼠脛股關節骨內壓，發揮對DH豚鼠退變脛股關節軟骨的保護作用。

MMPs是生長發育、傷口愈合和疾病病理生理過程中參與ECM重塑的酶。MMP13在生理pH值環境下調節原纖維膠原蛋白(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型)和聚集蛋白聚糖7水平。MMP13對膠原蛋白的切割發生在內部螺旋位點，產生1/4和3/4片段，并且在氨基端肽位點發生原纖維解聚[12]。MMP13未在健康成人組織中發現，但在骨關節炎患者的關節液及關節軟骨中顯著表達。此外，有研究表明，優先抑制MMP13的MMPs抑制劑可阻止骨關節炎中軟骨的降解[13]。人類膝退變關節軟骨細胞結合MMP13的能力增加，因此其損傷程度增加。膝退變關節軟骨中的軟骨細胞過表達MMP13，2型膠原是其底物[14]。基于這些發現，MMP13可能是治療退行性膝骨關節炎的靶點[15-17]。本次研究結果顯示，減壓組6、9、12、18月齡DH豚鼠脛股關節2型膠原mRNA和蛋白表達水平均明顯高于非減壓組；隨月齡增長，非減壓組、減壓組呈現出降低趨勢，至18月齡時，2型膠原mRNA和蛋白表達水平達到最低值。減壓組6、9、12、18月齡DH豚鼠脛股關節MMP13 mRNA和蛋白表達水平均明顯低于非減壓組；隨月齡增長，非減壓組、減壓組呈現出上升趨勢，至18月齡時，MMP13 mRNA和蛋白表達水平達到峰值。以上說明，骨內減壓能促進DH豚鼠退變脛股關節軟骨2型膠原mRNA和蛋白表達，抑制MMP13 mRNA和蛋白表達。

綜上所述，骨內壓干預能夠明顯降低DH豚鼠退行性脛股關節骨內壓，對退變關節軟骨具有明顯的保護作用；其機制與骨內減壓后在促進DH豚鼠退變脛股關節軟骨2型膠原mRNA和蛋白表達的同時，抑制MMP13 mRNA和蛋白表達相關。