苯磺酸芍藥苷通過調(diào)控頜下腺GRK2-JAK1-STAT1/2信號通路治療抗原誘導(dǎo)型小鼠干燥綜合征

吳華勛，陳曉蕓，劉 琪，張巧琳，黃 磊，周彤彤，魏 偉

(安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所,抗炎免疫藥物教育部重點實驗室，抗炎免疫藥物安徽省協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230032)

原發(fā)性干燥綜合征(primary Sj?gren Syndrome，pSS)發(fā)病累及唾液腺、淚腺等外分泌腺，臨床表現(xiàn)為口干、眼干[1]，并伴隨大量自身抗體產(chǎn)生，如抗SSA和SSB抗體等，以及高丙球蛋白血癥[2]。pSS患者男女比例約為1 ∶9。

pSS的發(fā)病機制較為復(fù)雜，可能與基因、感染等因素有關(guān)。感染因素中EB病毒、Coxsackie病毒等與pSS的發(fā)病緊密相連[3]。病毒的感染激活樹突細胞等免疫細胞分泌IFNα，發(fā)生適應(yīng)性免疫反應(yīng)[4]。唾液腺上皮細胞(salivary gland epithelial cells，SGECs)在IFNα或病毒的直接刺激下，分泌趨化因子如CXCL13，募集和活化淋巴細胞，使外分泌腺體發(fā)生淋巴細胞浸潤。JAK1-STAT1/2信號通路的激活可能與IFNα或病毒的直接刺激下趨化因子CXCL13的產(chǎn)生有關(guān)。

目前臨床上尚無療效明確的醫(yī)治pSS的藥物。研究顯示，白芍總苷(TGP)具備抗炎免疫調(diào)節(jié)效果，已廣泛用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、pSS等多種自身免疫病[5]，但起效慢，作用較弱。課題組通過對TGP主要成分芍藥苷(Pae)進行結(jié)構(gòu)改造，獲得了酯化產(chǎn)物苯磺酸芍藥苷(代號CP-25)，其生物利用度及抗炎免疫藥理作用明顯上升[6]。在關(guān)節(jié)炎的研究中發(fā)現(xiàn)，CP-25通過調(diào)節(jié)成纖維樣滑膜細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞等細胞的功能發(fā)揮其治療作用[7-8]。G蛋白偶聯(lián)受體激酶(G protein-coupled receptor kinase，GRK)經(jīng)磷酸化配體激活的G蛋白偶聯(lián)受體，使β-arrestin與之聚合，進而阻止G蛋白與受體偶聯(lián)，產(chǎn)生受體“脫敏”[9]。課題組研究發(fā)現(xiàn)，CP-25對小鼠實驗性關(guān)節(jié)炎的治療作用與其調(diào)節(jié)GRKs的活性相關(guān)[10]。實驗性干燥綜合征(experimental Sj?gren's Syndrome，ESS)小鼠經(jīng)CP-25治療后病癥有所改善[11-12]，CP-25作用的發(fā)揮是否與其調(diào)節(jié)GRK2與JAK1的結(jié)合，進而抑制JAK1-STAT1/2-CXCL13信號通路減少淋巴細胞浸潤有關(guān)？目前尚無文獻報道。

本實驗使用C57BL/6小鼠，采用頜下腺蛋白建立了抗原誘導(dǎo)ESS模型，確立CP-25對ESS小鼠模型的作用，探討其作用機制是否通過調(diào)節(jié)GRK2與JAK1的結(jié)合，抑制JAK1-STAT1/2-CXCL13信號通路而發(fā)揮作用，為以后探索CP-25的藥物機制具有現(xiàn)實意義。

1 材料

1.1 實驗動物動物:購自安徽省實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號碼:SCXK(皖)2011-002。為SPF級、體質(zhì)量約為18 g，♀ C57 BL/6小鼠。

1.2 實驗細胞人類頜下腺上皮細胞(human salivary gland epithelial cells，HSGECs)，購于European Collection of Authenticated Cell Cultures(ECACC)。

1.3 藥品與試劑CP-25由安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所提供，硫酸羥氯喹(150902)自上海中西制藥有限公司購買；戊巴比妥鈉(69020100)、毛果蕓香堿(PHR1494)購自美國Sigma公司；重組人IFN-α(NBP2-26651)、CXCL13抗體(NBP2-16041)購自Novus Biologicals公司；JAK1抗體(3344)、Phospho-JAK1抗體(3331)、Phospho-STAT1抗體(9167)、Phospho-STAT2抗體(4441)購自CST公司；STAT1抗體(sc-464)、STAT2抗體(sc-514193)、GRK2抗體(sc-13143)購自美國Santa Cruz公司。

1.4 主要實驗儀器Leica TCS SP8激光共聚焦顯微鏡，德國Leica公司；一體式化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，美國GE公司。

2 方法

2.1 ESS小鼠模型的建立、分組及給藥無菌取出C57BL/6小鼠雙側(cè)頜下腺，稱重，冰上勻漿器中研磨，勻漿放入管中，4 ℃離心(3 000 r，15 min)，BCA定量至5 g·L-1，等量弗氏完全佐劑乳化至2.5 g·L-1。d 0將上述乳化后的抗原皮內(nèi)多點注射至小鼠背部和尾根部，d 7再次注射。d 14將頜下腺抗原在等量弗氏不完全佐劑中乳化至2.5 g·L-1，注射加強免疫。

根據(jù)唾液流量，第6周剔除未成模小鼠，將小鼠分為:正常組、模型組、濃度為35、70 mg·kg-1的CP-25組和濃度為80 mg·kg-1的羥氯喹(hydroxychloroquine，HCQ)組。給藥組于第7周開始連續(xù)2周的灌胃給藥，同體積的0.5% CMC-Na給予正常組和ESS組。第9周處死小鼠。

2.2 小鼠唾液流率的檢測小鼠的唾液量在造模后第6、7、8、9周進行測定。小鼠經(jīng)2.4%戊巴比妥鈉麻醉后，將濃度為0.125 g·L-1的毛果蕓香堿腹腔注射，5 min后將已稱重的無菌棉球置于小鼠舌下，收集10 min，稱量后計算差值。

2.3 小鼠頜下腺HE檢測取頜下腺制作病理切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色，脫水、烘干后，鏡下觀察結(jié)果，拍照。

2.4 免疫組化法測定小鼠頜下腺CXCL-13水平小鼠頜下腺切片，經(jīng)脫蠟沖洗后，將一抗CXCL-13(1 ∶100)滴至切片組織上，4 ℃ 孵育過夜，沖洗后滴加反應(yīng)增強液孵育30 min，沖洗后加入適量DAB顯色液，脫水晾干后封片。鏡下觀察結(jié)果，拍照。

2.5 免疫印跡法測定小鼠頜下腺中JAK1-STAT1/2通路的表達取出小鼠頜下腺，稱重，加細胞裂解液，4 ℃冰上勻漿，BCA定量后，加入Loading Buffer煮樣；配膠、灌膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，孵育一抗(JAK1、p-JAK1、STAT1、p-STAT1、STAT2、p-STAT2，約以1 ∶1 000比例配置)；孵育二抗，于37 ℃恒溫搖床中孵育2 h；顯影液涂在PVDF膜上，使用化學(xué)發(fā)光成像儀顯影。ImageJ軟件條帶解析。

2.6 免疫熒光法測定HSGECs中CP-25對GRK2與JAK1共表達的作用培養(yǎng)HSGECs細胞，傳代時培養(yǎng)皿內(nèi)放入無菌蓋玻片，待HSGECs爬片后，IFN-α(10 μg·L-1)刺激48 h后；取出蓋玻片，固定、清洗，細胞通透使用0.5% Triton-100，BSA進行封閉，加一抗(JAK1，GRK2)孵育；清洗后滴加兩種對應(yīng)的熒光二抗，避光孵育；DAPI染色后加入防熒光淬滅劑進行封片；鏡下拍照并對共表達進行分析。

2.7 CO-IP檢測HSGECs中CP-25對GRK2與JAK1相互作用的影響將HSGECs接種于細胞培養(yǎng)皿中，分為對照組、濃度為10 μg·L-1的IFNα組、濃度為10-5mol·L-1的IFNα+CP-25組，培養(yǎng)48 h，洗滌細胞，加入裂解液(RIPA ∶PMSF=1 ∶99)置于冰上裂解，4 ℃離心取上清；部分作為input后，準(zhǔn)備Protein A agarose(1個樣品+20 μL珠子)，清洗珠子后留取液體，加入12 μL抗體(1個樣品+4 μL抗體)，4 ℃旋轉(zhuǎn)混勻；離心，將樣品與beads 結(jié)合置于4 ℃旋轉(zhuǎn)混勻器中過夜；離心，棄上清，將32 μL裂解液和8 μL電泳上樣緩沖液加入樣品中，煮沸，后續(xù)操作同WB。

3 結(jié)果

3.1 CP-25對ESS小鼠唾液量的影響造模后第7周，ESS模型組小鼠的唾液流率較正常組明顯降低。給藥1周，CP-25(70 mg·kg-1)組小鼠唾液流率較ESS小鼠明顯增加；給藥2周，劑量為35，70 mg·kg-1的CP-25組和劑量為80 mg·kg-1的HCQ組小鼠唾液流率明顯增多。

3.2 CP-25對ESS小鼠頜下腺病理的影響ESS小鼠頜下腺中淋巴細胞浸潤較正常組嚴(yán)重，聚集成灶，唾液腺的小葉結(jié)構(gòu)消失，局部小血管因炎癥擴張充血。與ESS模型組相比，濃度為70 mg·kg-1的CP-25和濃度為80 mg·kg-1的HCQ組中的頜下腺淋巴細胞浸潤明顯改善。

Fig 1 Effects of CP-25 on saliva flow in ESS n=8)**P<0.01 vs normal;#P<0.05 vs model

3.3 CP-25對ESS小鼠頜下腺CXCL-13表達的影響通過IHC測定小鼠頜下腺CXCL-13的水平，ESS小鼠頜下腺中CXCL13的水平較正常組明顯升高，可能與頜下腺上皮細胞表達相關(guān)。濃度為35，70 mg·kg-1的CP-25組較ESS組可明顯降低小鼠頜下腺中CXCL13的表達。

3.4 CP-25對ESS小鼠頜下腺JAK1-STAT1/2信號通路的影響CP-25對小鼠頜下腺中JAK1-STAT1/2的變化用WB檢測。ESS小鼠頜下腺中p-JAK1、p-STAT1、p-STAT2水平較正常組比明顯升高，提示ESS小鼠頜下腺JAK1-STAT1/2信號通路被激活。CP-25(70 mg·kg-1)和HCQ(80 mg·kg-1)組可明顯降低p-JAK1、p-STAT1、p-STAT2蛋白的表達，提示CP-25可抑制ESS模型小鼠頜下腺JAK1-STAT1/2通路的激活。

3.5 CP-25促進GRK2與JAK1的結(jié)合采用激光共聚焦檢測GRK2與JAK1共表達情況，結(jié)果顯示，GRK2與JAK1在HSGECs中均有表達，多存在于胞質(zhì)，其次是胞膜。與正常對照組相比，IFN-α刺激后，GRK2與JAK1共表達下降，CP-25(10-5mol·L-1)能提高GRK2與JAK1的共表達。CO-IP結(jié)果與免疫熒光相似，IFN-α刺激后，GRK2與JAK1相互結(jié)合作用減弱，CP-25(10-5mol·L-1)能提高GRK2與JAK1的結(jié)合。

4 討論

pSS是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫病，外分泌腺易產(chǎn)生灶性淋巴細胞浸潤。唾液流率及唇腺活檢是確診pSS的重要方法。在本實驗中，ESS小鼠采用頜下腺抗原誘導(dǎo)SS模型，唾液流率明顯減少，頜下腺病理中出現(xiàn)大量淋巴細胞浸潤，聚集成灶，證明模型誘導(dǎo)成功。ESS小鼠的唾液流率經(jīng)CP-25治療后明顯增加，頜下腺病理也得到改善。

對pSS患者唇檢時，多數(shù)患者產(chǎn)生異位生發(fā)中心(EGC)，這類患者淋巴細胞浸潤嚴(yán)重，與B淋巴細胞異常表達有關(guān)。B淋巴細胞參與pSS的發(fā)病表現(xiàn)在:遷移、聚集在炎性組織中造成EGC、B淋巴細胞亞群分布異常、分泌多種自身抗體等[13]。淋巴浸潤灶的形成有多種趨化因子和炎癥因子的參與，其中使B淋巴細胞發(fā)生遷移和聚集的趨化因子主要有CXCL13[14]，由樹突細胞及巨噬細胞分泌，是目前所知獨有的可與CXCR5受體結(jié)合的配體。在淋巴浸潤灶及EGC中，CXCL-13表達的異常加快了疾病的發(fā)生[15]。在NOD/LtJ小鼠SS模型中，采用抗CXCL-13抗體治療，可通過抑制B淋巴細胞在唾液腺組織的浸潤，使唾液腺炎癥反應(yīng)降低[16]。CXCL-13在pSS中明顯升高，可反映疾病的嚴(yán)重程度。本實驗中ESS小鼠頜下腺中CXCL-13的蛋白水平明顯升高，CP-25可明顯降低其表達。CXCL-13的表達還可能與SGECs分泌有關(guān)。

Fig 2 Effects of CP-25 on pathological of salivary gland in ESS miceA:Normal;B:Model;C:CP-25(35 mg·kg-1);D:CP-25(70 mg·kg-1);E:HCQ(80 mg·kg-1)

Fig 3 Effects of CP-25 on CXCL13 expression in salivary gland in ESS miceA:Normal;B:Model;C:CP-25(35 mg·kg-1);D:CP-25(70 mg·kg-1);E:HCQ(80 mg·kg-1)

Fig 4 Effects of CP-25 on JAK-STAT1/2 expression in salivary gland in ESS mice n=3)1:Normal;2:Model;3:CP-25(35 mg·kg-1);4:CP-25(70 mg·kg-1);5:HCQ(80 mg·kg-1);**P<0.01 vs normal;#P<0.05 vs model

Fig 5 Effects of CP-25 on co-expression of GRK2 and JAK1*P<0.01 vs normal;#P<0.05 vs model.A.The effects of CP-25 on the co-expression of GRK2 and JAK1 by immunofluorescence;B.The effects of CP-25 on the combination of GRK2 and JAK1 by CO-IP n=3)

SGECs可表達多種共刺激分子、粘附分子及B 細胞活化分子具有抗原提呈作用。SGECs不僅是異常免疫反應(yīng)的靶細胞，在IFNα和病毒的刺激下可分泌BAFF、IL-6、CXCL12和CXCL13等，促進B 細胞、T 細胞、DC 細胞的聚集[17]。因此，SGECs作為效應(yīng)細胞啟動和維持了免疫反應(yīng)。在pSS的發(fā)病機制中，由細菌、病毒、RNA等引發(fā)IFN的大量產(chǎn)生，進而引起免疫細胞及細胞因子的異常改變越來越受到關(guān)注。細胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)可能由IFNs經(jīng)過JAK-STAT激活，產(chǎn)生多種炎性細胞因子及趨化因子如CXCL-13，JAK/STAT信號級聯(lián)可能是IFN發(fā)揮作用的關(guān)鍵途徑[18]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，ESS模型小鼠頜下腺中p-JAK1、p-STAT1和p-STAT2表達明顯升高，JAK1-STAT1/2激活；CP-25可明顯抑制JAK1-STAT1/2信號的活化，可能進而降低了CXCL-13的表達。

目前臨床上治療pSS尚無理想藥物。大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，TGP治療pSS有明確療效，但起效較慢。CP-25對NOD/LtJ小鼠自發(fā)型、C57BL/6小鼠抗原誘導(dǎo)型干燥綜合征模型均具有明顯的治療作用[11-12]。本實驗中，CP-25可能通過抑制JAK1-STAT1/2-CXCL13信號活化而降低B淋巴細胞的遷移，發(fā)揮對抗原誘導(dǎo)型ESS模型小鼠的治療作用，CP-25作用的靶蛋白GRK2是否對JAK1有直接作用呢？本實驗通過免疫熒光共定位及CO-IP檢測發(fā)現(xiàn)，GRK2與JAK1在HSGECs中均有表達，IFNα刺激后，GRK2與JAK1共表達下降，CP-25(10-5mol·L-1)能提高GRK2與JAK1的共表達。CO-IP結(jié)果與免疫熒光相似，IFN-α刺激后，GRK2與JAK1相互結(jié)合作用減弱，CP-25(10-5mol·L-1)能提高GRK2與JAK1的結(jié)合。

根據(jù)以上結(jié)果推測，CP-25可能通過抑制GRK2的轉(zhuǎn)膜，而恢復(fù)胞質(zhì)內(nèi)GRK2與JAK1的結(jié)合，進而抑制JAK1-STAT1/2-CXCL13信號的活化，降低B淋巴細胞的遷移、浸潤，改善頜下腺淋巴浸潤灶，提高唾液流率，發(fā)揮對ESS小鼠的治療作用。本課題為研究CP-25治療ESS的作用機制奠定了實驗基礎(chǔ)，并為今后CP-25的臨床使用提供了理論依據(jù)。