氣液界面培養小鼠氣管上皮細胞模型構建

冀曉麗，胡 玥，盛云華，唐黎明

(上海市食品藥品檢驗所 藥理毒理室/藥物安全評價中心，國家藥品監督管理局化學藥品制劑質量分析重點實驗室，上海 201203)

呼吸道體外模型常被用于研究外源性化合物、吸入制劑、空氣污染物、納米顆粒物、煙草制品等暴露誘導的吸入毒性和肺部疾病[1]。目前，體外吸入毒性評價多采用穩定傳代的細胞系，如A549、Calu3、16HBE、BEAS-2B等構建呼吸道上皮的模型，然而這些細胞系的生理特征與體細胞之間差異較大，對呼吸系統的特征反應具有一定局限性[2]。呼吸道上皮細胞是機體呼吸道防御系統的重要屏障，它形成的假復層纖毛柱狀上皮將人體的內環境與外界環境有效隔離[3]，呼吸道氣管和支氣管組織表面分布的細胞包括纖毛細胞、分泌黏液的杯狀細胞、無纖毛細胞和基底細胞等[3]。因此，唯有原代培養呼吸道上皮細胞才能在生理功能和結構上更貼近體內氣管上皮細胞的自然生長狀態，成為研究氣管上皮功能和相關疾病的重要體外模型[4]。

氣液體界面(air-liquid interface，ALI)培養技術是培養呼吸道上皮細胞的重要方法，ALI培養的研究在國外已有多年的歷史[5]，但目前國內也只有少數實驗室成功建立了該培養平臺，而且不同實驗室采用的方法各異[6]。其中包括原代細胞的分離方法、ALI培養基成份、預鋪膠原類型的選擇、細胞的接種密度等都各不相同[7-8]。本研究建立的小鼠氣管上皮細胞(mouse tracheal epithelial cells，MTEC)分離和分化培養模型，是從小鼠體內分離氣管后，通過ALI培養上皮細胞逐步分化出纖毛，為研究纖毛的形成和氣道上皮發育的最佳模型[9]。ALI培養方法的優點，是可以利用體外暴露裝置將外源性氣溶膠沉積在上皮細胞表面，最大限度地減少各類氣溶膠的變性，從而模擬人體呼吸道暴露環境致病因素的生物學特性[10]。本研究對該模型培養細胞的生長狀態、緊密連接的形成及細胞分化纖毛等方面進行了評估，為后續外源化合物毒性評價提供了成熟的體外吸入暴露模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 C57BL/6小鼠，成年♂，8周齡，體質量大于20 g。1只小鼠大約可收集(15-20)萬個細胞。來源：上海靈暢生物科技有限公司，生產許可證號：SCXK(滬)2018-0003，動物飼養于上海市食品藥品檢驗所動物房，動物飼養房間的溫度：(20-25) ℃，濕度：40%-70%，本試驗符合實驗動物倫理原則，已通過上海市食品藥品檢驗所實驗動物管理和使用委員會的審查，編號為IACUC-SIFDC19132。

1.1.2試劑 DMEM/F12培養基(Gibco，批號：11330032)；Ham’s/ F12培養基(Gibco，批號：3175068)；青霉素/鏈霉素(Penicillin/streptomycin，Gibco，批號：10378016)；胎牛血清(FBS，Hyclone，批號：DBC0520)；磷酸鹽緩沖液(PBS，Corning，批號：26318001)；平衡鹽溶液(HBSS，Gibco，批號：14175095)；鏈霉蛋白酶(Pronase，Roche，批號：10165921001)；脫氧核糖核酸酶(DNasel，Sigma，批號：DN25)；牛血清白蛋白(BSA，absin，批號：abs9157)、胰島素(Insulin，Sigma，批號：16634，)；轉鐵蛋白(Transferrin，Sigma，批號：T1147)；表皮生長因子(EGF，Sigma，批號：E9644)；維甲酸(RA，Sigma，批號：R265)、霍亂毒素(CT，absin，批號：abs8001)；牛垂體提取物(BPE，absin，批號：abs9919)；Ⅳ型膠原(Pure col，BioMatrix，批號：5005)；抗熒光淬滅封片液(Beyotime，批號：P0126)；DAPI(BD，批號：)；Transwell?-Clear培養板(Corning-Costar，批號：3450)PrimariaTM組織培養皿(Corning，批號：353803)。抗體 α-tubulin (abcam,貨號：ab24610)；β-tubulin-Ⅳ(abcam，貨號：ab179509)ZO-1(Cell Signaling Technology，貨號：#13663)；Foxj1(eBiosciences，貨號：14-9965-80)；MUC5AC(Cell Signaling Technology，貨號：#61193)；Anti-Rabbit IgG(Cell Signaling Technology，貨號：#4412)；Anti-Mouse IgG(Cell Signaling Technology，貨號：#4409)。

1.1.3儀器 Heracell VIOS 160i CO2培養箱(德國Thermo Scientific公司)；BCM-1300A層流超凈臺(Airtech公司)；Vi-cell XR細胞活力測定儀(德國Beckman counter公司)；THUNDER Imager 3D Live Cell(德國 Leica公司)；Olympus IXplore SpinSR10轉盤共聚焦系統(日本 Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1培養小室膠原包被 膠原是基膜的主要成分，將細胞培養皿包被膠原，模擬基膜的內環境。將商品化的Ⅳ型膠原3 g·L-1，用無菌水稀釋為30-50 mg·L-1，加入12孔或24孔Transwell過濾膜小室中，每孔加0.5-1 mL。37 ℃ 培養箱孵育過夜。d 2，吸出膠原蛋白涂層溶液，讓濾膜風干5 min，放置于生物安全柜中，紫外線消毒。再用無菌PBS沖洗小室和基底層3次，去除游離膠原蛋白。包被好的Transwell培養皿在4 ℃條件下，可存放8周左右。

1.2.2增殖培養基及分化培養基的配置 原代氣管上皮細胞的培養基配制是細胞增殖、分化的關鍵因素，直接影響纖毛分化的成功與否，該研究通過多次分離氣管培養試驗，總結出細胞增殖與分化的培養基配比成分與濃度。

(1)氣管上皮增殖培養基配制：取475.5 mL DMEM/F12加入7.5 mL HEPES溶液，10 mL谷氨酰胺，2 mL 7.5% NaHCO3溶液，5 mL青霉素/鏈霉素。取45 mL配制好的DMEM/F12細胞培養基加入5 mL 胎牛血清作為基礎培養基，隨后取45.7 mL基礎培養基加入2.5 mL胎牛血清，50 μL 5μmol·L-1維甲酸，250 μL胰島素溶液，250 μL表皮生長因子，200 μL牛腦垂體提取物，50 μL轉鐵蛋白溶液，50 μL霍亂毒素溶液，過濾消毒后4 ℃保存可使用2 d。具體濃度如Tab 1。

Tab 1 MTEC Plus medium recipe

(2)氣管上皮分化培養基配制：取上一步配制好的基礎培養基250 mL，添加625 μL胰島素，250 μL轉鐵蛋白，62.5 μL霍亂毒素溶液，250μL表皮生長因子,7.5 mg牛腦垂體提取物，2.5 mL BSA，最終容量250 mL，使用前加入 250 μL 5 μmol·L-1維甲酸，過濾消毒后4 ℃保存可使用2 d。具體濃度如Tab 2。

Tab 2 MTEC ALI expansion medium recipe

1.2.3小鼠氣管的分離與消化 d 1：小鼠采用頸椎脫位處死，避免破壞頸部和氣管組織；在組織培養罩與解剖鏡下，取出氣管，去除附著組織，將每根清洗過的氣管放入無菌Ham’s/ F12培養基中，置于冰上。使用眼科剪把每個氣管縱向切開，放入新鮮配制的Pronase中，大約3 mL的Pronase可以覆蓋10-30個氣管。4 ℃孵育過夜，冰箱放置18-24 h，切勿倒置。d 2：取出裝有氣管的Pronase離心管，顛倒5次，室溫放置10 min；加入預熱37 ℃的FBS，終體積為10%；依次加入Ham’s/ F12培養基，丟棄氣管，留下培養基，4 ℃，500 ×g，離心10 min；吸取上清液，留下細胞沉淀，用DNasel重懸細胞，體積為200 μL/氣管；使用基礎培養基DMEM/F12重懸細胞，采用差速貼壁法，將收獲的原代細胞接種在PrimariaTM組織培養皿中，放置于細胞培養箱4-6 h，使貼壁速度較快的成纖維細胞貼壁，上皮細胞懸浮；將懸浮細胞收集在離心管中，4 ℃，500 ×g，離心5 min；室溫下，吸出上清液，加入Table 1配制好的MTEC增殖培養基，采用細胞計數儀，計算懸液中活細胞數量，接種細胞在包被好Ⅳ型膠原的Transwell培養皿中，每孔接種細胞數量參考Tab 3。

Tab 3 Media volumes and cell numbers for MTEC cultures on supported membranes (Transwell?,Corning)

1.2.4免疫熒光標記方法 使用外科手術刀片從12孔或24孔Transwell細胞培養板中，取下小室的過濾膜，放入干凈的細胞培養板中，直接加入4%多聚甲醛，搖床固定10 min，PBS 清洗2次，每次5 min；(0.2-0.5)% Triton-100 對細胞透化處理30 min，PBS 清洗2次，每次5 min；5% BSA室溫搖床上孵育2 h，PBS 清洗2次，每次5 min。根據抗體稀釋比例(1 ∶500/1 000)，用一抗稀釋液稀釋抗體，4 ℃搖床孵育過夜；d 2，取出過濾膜，PBS 清洗2次，每次5 min，羊抗鼠 IgG二抗、兔抗鼠 IgG二抗，濕盒內 37 ℃孵育 2 h；PBS 清洗兩次，每次5 min；加入預先配制好的 DAPI，常溫避光在搖床緩慢孵育。染色后用共聚焦顯微鏡觀察，拍照。

1.2.5掃描電鏡方法(SEM) MTEC培養d 14-21，收集細胞電鏡拍照。使用外科手術刀片，取下Transwell小室的過濾膜，放入干凈的細胞培養板中，PBS清洗3遍；加入2.5%的戊二醛，4 ℃冰箱固定過夜；0.1 mol·L-1PBS 漂洗3次，每次10 min；1%餓酸固定液固定1-1.5 h，PBS漂洗3次，每次10 min；梯度脫水，30%乙醇10 min，50%乙醇10 min，70%乙醇10 min，80%乙醇10 min，95%乙醇10 min，100%乙醇(無水硫酸鈉處理)10 min，重復處理2次；臨界點干燥，在沒有表面張力的條件下干燥，最大程度保存樣品原貌；鍍膜儀噴金，厚度為15 nm左右；通過掃描電子顯微鏡(Quanta 200，FEI，USA)觀察拍照。

1.2.6跨上皮電阻檢測(TEER) 采用Millicell?細胞電阻儀，在MTEC增殖與ALI分化的不同時間，監測細胞跨上皮電阻值(TEER)，12孔Transwell培養板，每孔測量 3個有效TEER值，3個孔數據，統計分析。跨上皮電阻值用以下公式進行校正：TEERture(Ωcm2)=(TEERsample-TEERblank)(Ω)×Effective Membrane Area(cm2)。式中：TEERsample:樣品粗測值；TEERblank:空白值；Effective Membrane Area:有效生長面積。

2 結果

2.1 MTEC培養不同時期細胞形態特征小鼠氣管分離上皮細胞，均勻鋪板，細胞增殖1-2 d，避免影響貼壁，不做移動。細胞培養3 d后，更換加入新鮮RA的增殖培養基(Tab 1)，通過倒置顯微鏡觀察細胞生長狀況(Fig 1)，細胞培養2 d后，完全貼壁，細胞形態拉長變大；細胞增殖3-5 d，數量增加，鏡下可見團塊狀細胞島；細胞增殖5-7 d，融合度達到100%，測定細胞跨上皮電阻值(Rt)，Rt超過1 000 Ω·cm2后，更換氣液界面培養，記作ALI d 0。從Transwell小室吸出培養基，在基底層加入新鮮無血清培養基(Tab 2),頂層小室保持干燥。隔天換一次基底層培養基，用PBS清洗小室細胞，細胞可在ALI條件下分化，ALI培養d 3-5，細胞變小變圓，呈現立體形態。ALI培養d 7-14，細胞分化良好，出現鵝卵石樣外觀，鏡下可見纖毛擺動，濾膜表面至少有30%纖毛細胞。

Fig 1 Appearance of MTEC on membranes by light microscopy during culture(×100)

2.2 MTEC緊密連接和細胞極化的形成使用跨上皮電阻儀對MTEC培養過程的不同時期進行TEER值(Rt)的測定，評價細胞間緊密連接的形成情況。試驗結果顯示(Fig 2)，浸沒式培養細胞5-7 d后，單層細胞接近完全融合，細胞跨上皮電阻值增加，Rt值>1 000 Ω·cm2，轉化為氣液界面培養。ALI d 0，Rt值為(1 830±17) Ω·cm2；ALI d 5，Rt值增加到(2 180±169) Ω·cm2；，ALI d 10，Rt值增加到(2 970±242) Ω·cm2。隨著ALI培養時間的延長，細胞逐漸分化，ALI d 15，跨上皮電阻值逐漸降低(1 930±52) Ω·cm2。為了將Rt的增加與基因特異性表達相關聯，我們對緊密連接蛋白ZO-1進行了評估。ZO-1的表達也提示了細胞大小和數量的改變，我們發現細胞數量在培養的第一周內明顯增加，免疫熒光檢測各組細胞膜連接中ZO-1在ALI培養不同時間的表達(Fig 3)。

2.3 MTEC分化不同時期纖毛形態掃描電鏡結果通過掃描電鏡觀察小鼠氣管上皮細胞表面形態(Fig 4)。照片顯示，ALI培養d 5-7上皮細胞大而扁平，細胞均勻，有微絨毛，也有少量纖毛。在細胞增殖后，ALI培養過度到上皮細胞分化階段。上皮細胞分化d 14-20后，ALI培養的MTEC表面形態與小鼠氣管形態相似。起初上皮細胞外觀，纖毛短且不動，隨著時間延長，纖毛變化長度直到成熟。ALI d 7-14，可以觀察到運動的成簇的纖毛。

Fig 2 TEER assessment of epithelial cells cultured at an air-liquid interface

Fig 3 Expression of ZO-1 in cell membrane junctions detected by immunofluorescence at indicated days

Fig 4 Differentiation of MTEC assessed by scanning EM at indicated days

2.4 MTEC分化不同時期β-tubulin蛋白定位與表達β-微管蛋白-Ⅳ(β-tubulin-Ⅳ)的表達標記纖毛軸絲的形成，藍色熒光為DAPI染色的細胞核，免疫熒光試驗在MTEC氣液界面培養的不同時間，標記纖毛在細胞分化不同時期的形態特征(Fig 5)。ALI培養6 d β-tubulin標記細胞形態較大，可見微管蛋白典型特征。ALI d 12，細胞形態變圓變小，β-tubulin標記可見典型細胞有絲分裂，纖毛軸絲形成。ALI d17，纖毛分化狀態良好，形態清晰，成簇狀分布在纖毛細胞的表面，具有纖毛柱狀上皮細胞的特征。通過對纖毛的鑒定，可看出本實驗構建的小鼠氣管假復層柱狀上皮模型的纖毛細胞分化良好。

2.5 MTEC假復層纖毛上皮相關蛋白定位與表達氣液界面培養25 d后，上皮細胞已完全分化，細胞邊界更加清晰，排列更加緊密，上層有粘液分泌。初級和運動的纖毛可以用乙酰化的α-微管蛋白(α-tubulin)、β-微管蛋白-Ⅳ(β-tubulin-Ⅳ)抗體來標記，分泌的粘液可以用粘液蛋白MUC5AC進行標記，MUC5AC蛋白主要是由上皮細胞中的杯狀細胞分泌和合成的，對MUC5AC的檢測能夠說明杯狀細胞的分化形成。如Fig 6，結果顯示細胞的纖毛分化狀態良好，纖毛清晰，成簇狀分布在纖毛細胞的表面，纖毛細胞在上皮中分布均勻且數量較多，具有纖毛柱狀上皮細胞的特征。綠色熒光分別標記3種抗體，從而在蛋白的水平上證明了纖毛細胞與分泌細胞的分化形成，但杯狀細胞的數量較纖毛細胞少。

Fig 5 Immunofluorescence and confocal microscopy of β-tubulin at an air-liquid interface

Fig 6 Immunofluorescence and confocal microscopy of ciliated cell cultured at an air-liquid interface

3 討論

原代氣管上皮細胞為假復層纖毛柱狀上皮，其正常生理功能的實現取決于細胞分化程度以及細胞極性的形成與維持。細胞單層生長的情況下，使用無極性和低分化的原代培養細胞和永生化細胞系對于呼吸道上皮細胞研究來說價值有限，并不能完全反映體內生理功能。本研究總結的小鼠氣管上皮細胞原代培養方法，是將成年小鼠氣管通過蛋白酶消化分離得到上皮細胞，隨后接種到預先包被膠原的Transwell半透膜中，在氣液界面的條件下進行培養。本文通過對培養基改造(無血清培養)和培養皿膠原包被的特殊處理，實現了對小鼠呼吸道上皮細胞穩定有效的大量獲取，與其他已有實驗相比，具有獲得細胞數量穩定、可靠、分化程度高等優勢[11]。當細胞完全融合后，細胞間形成緊密連接，構成完整的生物屏障作用，通過細胞跨上皮電阻檢測和緊密連接蛋白的表達與定位，評價細胞間緊密連接形成與細胞極化分析。細胞在分化培養基中過渡到氣液體界面(air-liquid interface，ALI)培養條件，經過一段時間的ALI培養后，上皮細胞經過分化后能產生纖毛細胞、杯狀細胞、基細胞等多種細胞，并由細胞分泌的粘液覆蓋，產生類似于體內生理結構和功能的假復層纖毛柱狀上皮組織。氣液界面培養技術的廣泛應用，為吸入毒理學的體外研究提供了技術支持[12]。ALI模型培養的細胞在功能和結構上都貼近體內氣管上皮細胞的自然生長狀態，為研究氣管上皮的功能和相關疾病奠定了良好的基礎[13]。在呼吸系統疾病研究方面，ALI培養提供了一種有效的細胞模型，被廣泛地應用于多種呼吸道病毒的分離培養和致病機制的研究。

本研究結果顯示，小鼠氣管分離得到上皮祖細胞需要2 d；小鼠氣管、基底細胞在浸沒培養中增殖，直到融合并產生初級纖毛需要5-10 d；細胞融合后，轉為氣液界面培養，誘導分化為多纖毛細胞和其他類型的氣道上皮細胞需要10-14 d；成熟的假復層纖毛柱狀上皮可以存活40 d左右。纖毛細胞形成開始于ALI培養后2-5 d。在隨后的1周內，在其他基底細胞中誘導分化，因此在ALI 培養14 d后，超過30%的上皮細胞是多纖毛細胞。由于在體內難以研究活動纖毛的生物作用，且缺乏多纖毛細胞[14]。因此，本研究利用纖毛蛋白的免疫熒光標記，識別和表征纖毛形成途徑的不同階段。在氣管和MTEC中，活動的纖毛發生是高度不同步的，因此本文描述的細胞培養時間是近似的，在這個過程的大多數階段，免疫標記的結構與電子顯微鏡鑒定的形態特征相關[15]。緊密連接蛋白ZO-1在MTEC增殖與分化的不同時期，表達穩定。MTEC細胞呈立體結構，細胞核位置低于細胞表面。因此，觀察小室細胞的結構，用緊密連接蛋白定位比標記細胞核更有利用觀察。

通過實驗表明，MTEC增殖和分化的培養方法和條件較復雜，各種生長因子，特別是胰島素、轉鐵蛋白、表皮生長因子和維甲酸對細胞增殖、纖毛形成和粘液細胞分化至關重要。本研究參照已有文獻[16]，對已有方法進行優化，采用低溫過夜酶消化法，保持了分離到的細胞活性，在無血清的培養環境中獲得生長和維持分化的上皮細胞。采用差速貼壁法，促進了細胞的增殖，并消除了成纖維細胞的污染，提高了培養細胞的純度；在培養皿中預鋪Ⅳ型膠原，為細胞提供了生長基質，促進細胞的貼壁生長[17]。試驗研究結果表明，小鼠原代氣管上皮細胞(mouse tracheobronchial epithelial cells，MTEC)模型構建成功，后續可作為外源性化合物毒性篩選、吸入制劑安全性評價及毒性機制研究的最佳模型[18]。