白藜蘆醇調(diào)節(jié)卵清蛋白誘導的小鼠過敏性鼻炎的作用機制研究

李棟才，王 鵬，李 勝，于巧蓮，藍建平，程保輝

(深圳市龍崗區(qū)耳鼻咽喉醫(yī)院耳鼻咽喉科，深圳市耳鼻咽喉研究所，深圳市耳鼻咽喉重點實驗室，廣東 深圳 518172)

過敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)屬于I型變態(tài)反應性疾病，是機體受到過敏原刺激后產(chǎn)生的特異性免疫應答，引起鼻黏膜組織炎癥和生理功能紊亂的一種疾病。據(jù)流行病學統(tǒng)計，全球范圍內(nèi)10%-40%的人口患有過敏性鼻炎[1]。基于2005-2011年過敏性鼻炎流行病學調(diào)查數(shù)據(jù)，我國過敏性鼻炎發(fā)生率為17.6%，過敏性鼻炎發(fā)生率呈現(xiàn)連年升高趨勢[2]。目前過敏性鼻炎治療以糖皮質(zhì)激素噴鼻治療、特異性免疫療法(specific immunotherapy，SIT)和口服應用抗組胺、抗白三烯藥物為主[3]。SIT療法周期長，病人依從性差，治療結(jié)果個體差異大[4]。臨床中斷應用抗過敏藥物，過敏癥會反復發(fā)作[5]。因而，尋找新的抗過敏藥物或療法已勢在必行。

隨著人們生活水平提高，過敏患者開始注重通過調(diào)節(jié)飲食來防治過敏，因而對植物來源、具有預防和治療過敏的天然成分產(chǎn)生了濃重的興趣[6-7]。白藜蘆醇(resveratrol)具有廣泛的抗過敏、抗炎、抗氧化作用，在過敏性哮喘治療方面引起了廣泛關注和討論[8-10]，但是白藜蘆醇對過敏性鼻炎的治療作用和機制仍有待進一步研究。白藜蘆醇對過敏性鼻炎的調(diào)節(jié)作用和免疫學機制的闡明，將有助于合理應用白藜蘆醇預防和治療過敏性鼻炎。本文中，我們基于卵清蛋白誘導的小鼠過敏性鼻炎模型，探討白藜蘆醇對過敏性鼻炎的治療作用和免疫學機制，以期為應用白藜蘆醇緩解鼻炎相關過敏癥狀提供相關研究基礎。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和儀器6周齡雌性Balb/c小鼠,體質(zhì)量(20±2)g，由廣東省實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證編號SCXK(粵)2013-0002；該動物實驗通過深圳市龍崗區(qū)耳鼻咽喉醫(yī)院(深圳市耳鼻咽喉研究所)實驗動物倫理委員會批準(編號：龍耳醫(yī)動倫[2020]第0101號)，相關實驗在深圳市耳鼻咽喉研究所開展。

主要試劑和儀器：地塞米松(Sigma-Aldrich中國，批號D4902)；白藜蘆醇(Macklin Inc.，批號R817263)；IL-4、IL-10、IL-13、IL-17、IFN-γ和卵清蛋白特異性IgE(OVA-sIgE)ELISA試劑盒(CUSABIO武漢華美，批號分別為CSB-E04634m、CSB-E04594m、CSB-E04602m、CSB-E04608m、CSB-E04578m和CSB-E08914m)；流式抗體APC anti-mouse CD4抗體、PE anti-mouse GATA3抗體(BD Biosciences，批號分別為553051、560074)，達優(yōu)小鼠淋巴細胞分離液(深圳市達科為生物工程有限公司，批號DKW33-R0100/DKW33-R0400)，細胞固定破膜劑(eBioscience，批號88-8824-00)，BD FACSCanto II流式細胞儀(BD Bioscience，USA)，酶標儀SpectraMax Paradigm Multi-Mode Microplate Reader(Molecular Devices,USA)，臺式高速冷凍離心機(Thermo，USA)，Nikon Eclipse Ci-L/S顯微鏡(Nikon,Japan)及配套的電腦端數(shù)碼影像系統(tǒng)，Leica RM2245切片機(Leica，German)。

1.2 小鼠過敏性鼻炎模型造模6周齡Balb/c雌性小鼠(動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2018-0002)隨機分為正常對照組(normal control，NC)、過敏性鼻炎模型組(allergic rhinitis，AR)、白藜蘆醇低劑量治療組(low dose of resveratrol 30 mg·kg-1，RL)、白藜蘆醇高劑量治療組(high dose of resveratrol 100 mg·kg-1，RH)治療組、地塞米松治療組(dexamethasone 10 mg·kg-1，Dex)，共5組，每組6只。AR模型組、RL組、RH組、Dex組于d 1、7、14，腹腔注射卵清蛋白(ovalbumin，OVA)+氫氧化鋁致敏(NC組腹腔注射等體積的生理鹽水)；于d 21、28、35、39分別進行OVA滴鼻激發(fā)(NC組給予等體積的超純水)。RL組、RH組、Dex組從d 1開始，以灌胃的方式隔天給藥1次(NC組灌胃給予等體積的生理鹽水)。

1.3 小鼠鼻炎癥狀評價在末次給藥后2 h，卵清蛋白溶液對小鼠鼻腔進行局部刺激，即刻將小鼠置于單獨的鼠籠中，觀察15 min，記錄各組小鼠撓鼻和打噴嚏的次數(shù)。

1.4 小鼠血清中過敏相關細胞因子水平檢測記錄各組小鼠撓鼻和打噴嚏的次數(shù)后，麻醉小鼠，眼球取血，靜置2 h后，1 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，取上層血清。按照IL-4、IL-10、IL-13、IL-17、IFN-γ和卵清蛋白特異性IgE(OVA-sIgE)ELISA試劑盒操作方法，檢測小鼠血清中IL-4、IL-10、IL-13、IL-17、OVA-sIgE水平。

1.5 鼻黏膜組織學形態(tài)評價去除小鼠面部皮毛，取小鼠鼻部器官于10%福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋，5 μm切片，梯度乙醇脫水，進行蘇木紅和伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，光學顯微鏡下分析炎癥細胞浸潤情況。

1.6 流式細胞術檢測脾臟中Th2細胞比例參考達科為小鼠脾臟淋巴細胞分離方法，分離小鼠脾臟淋巴細胞；各組小鼠脾臟淋巴細胞經(jīng)固定、破膜后，進行CD4和GATA3流式抗體染色，BD FACS Canto II流式細胞儀分析各組CD4+GATA3+Th2細胞比例。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對過敏性鼻炎小鼠撓鼻和打噴嚏行為的影響于d 39，最后一次卵清蛋白激發(fā)后，將小鼠單獨置于鼠籠中，觀察小鼠撓鼻和打噴嚏次數(shù)。正常組小鼠卵清蛋白噴霧激發(fā)后，15min 內(nèi)撓鼻次數(shù)為0.5[0,2]次，卵清蛋白誘導的鼻炎模型組中小鼠撓鼻次數(shù)上升至25.5[24,28](P<0.01)；經(jīng)低劑量和高劑量白藜蘆醇治療后，撓鼻次數(shù)分別顯著降低到21[19,26](P<0.05)和6[5,7]次(P<0.01)(Fig 1A)。正常組小鼠卵清蛋白噴霧激發(fā)后，15分鐘內(nèi)打噴嚏次數(shù)為0[0,0]次，卵清蛋白造模的鼻炎模型組中小鼠打噴嚏次數(shù)上升至10[9,12](P<0.01)；經(jīng)低劑量和高劑量白藜蘆醇治療后，撓鼻次數(shù)分別顯著降低到7.5[6,8](P<0.01)和3.5[3,4]次(P<0.01)(Fig 1B)。地塞米松治療后，撓鼻次數(shù)和打噴嚏次數(shù)，相較于鼻炎模型組分別降低至5[4,6](P<0.01)和2.50[2,3](P<0.01)(Fig 1)。

2.2 白藜蘆醇對過敏性鼻炎小鼠鼻黏膜組織形態(tài)的影響HE染色結(jié)果顯示，正常組(NC)小鼠鼻黏膜中基本沒有炎細胞浸潤，卵清蛋白誘導的過敏性鼻炎模型組(AR)小鼠鼻黏膜有明顯紅腫現(xiàn)象，炎性細胞浸潤較為嚴重，白藜蘆醇高劑量組(RH)及地塞米松治療組(Dex)小鼠鼻黏膜紅腫現(xiàn)象減輕，炎性細胞浸潤狀況也相應減少(Fig 2)。低劑量白藜蘆醇(RL)治療對鼻黏膜紅腫和炎細胞浸潤改善作用不明顯。

2.3 白藜蘆醇對過敏性鼻炎小鼠血清中過敏相關細胞因子水平的影響卵清蛋白誘導過敏性鼻炎模型組(AR)中，血清中IL-4(54.38±10.47，P<0.000 1)、IL-13(29.96±5.97，P<0.01)和OVA-sIgE(0.91±0.14，P<0.01)水平均高于正常組(NC)IL-4(4.70±0.57)、IL-13(2.02±0.59)、OVA-sIgE(0.04±0.01)。與過敏性鼻炎模型組(AR)比較，高劑量白藜蘆醇治療組(RH)小鼠血清中IL-4(30.09±2.46，P<0.01)、IL-13(12.49±1.25，P<0.05)、OVA-sIgE(0.55±0.08，P<0.05)水平明顯降低。低劑量白藜蘆醇(RL)治療前后，IL-4(36.28±3.66)、IL-13(24.01±6.19)、OVA-sIgE(0.62±0.13)水平同過敏性鼻炎組差異無顯著性。地塞米松(Dex)治療組小鼠血清中IL-4(5.67±1.00，P<0.01)、IL-13(11.09±1.97，P<0.05)、OVA-sIgE(0.47±0.05，P<0.01)水平相較于過敏性鼻炎模型組明顯降低。正常對照組、過敏性鼻炎模型組、及白藜蘆醇治療組和地塞米松治療組，各組之間小鼠血清IL-10、IL-17和IFN-γ水平均未表現(xiàn)出明顯區(qū)別。見Fig 3。

Fig 1 Impacts of resveratrol on nasal rubbing and sneezing behaviors in OVA-induced allergic rhinitisNasal rubbing and sneezing frequencies in allergic rhinitis group (AR) increased notably compared to normal control group (NC),and the promoted nasal rubbing and sneezing frequencies were reversed after treatment with high dose (RH) and low dose resveratrol (RL) and dexamethasone (Dex),##P<0.01 vs NC,*P<0.05,**P<0.01 vs AR,n=6.

Fig 2 Resveratrol alleviated inflammatory infiltration and improved mucosal integrity in OVA-induced allergic rhinitis mouse model

2.4 白藜蘆醇對過敏性鼻炎小鼠脾臟中CD4+GATA3+Th2細胞比例的影響流式細胞術結(jié)果顯示，CD4+GATA3+Th2細胞在正常組小鼠脾臟淋巴細胞中的表達水平為(7.89±1.97)%，卵清蛋白誘導的過敏性鼻炎模型組中CD4+GATA3+Th2細胞比例為(12.09±3.10)%(P<0.05)，高于正常對照組。經(jīng)白藜蘆醇治療后，同鼻炎模型組比較，白藜蘆醇低劑量組[(4.10±2.88)%，P<0.01]和高劑量組[(3.20±1.43%，P<0.01)]中CD4+GATA3+Th2細胞比例均降低。地塞米松治療后，小鼠脾臟中CD4+GATA3+Th2淋巴細胞CD4+T細胞中占比顯著下降為[(4.08±1.50)%,P<0.01，見Fig 4]。

Fig 3 Effects of resveratrol on sera allergic cytokines in OVA-induced allergic rhinitis mice (,n=6)A:Treatment with high dose of resveratrol decreased sera levels of OVA-sIgE notably;B:Treatment with high dose of resveratrol decreased sera levels of IL-4 and IL-13 in allergic rhinitis dramatically,but no significant changes were observed in IFN-γ,IL-10 and IL-17 among NC,AR,RL,RH and Dex group;##P<0.01 vs NC,*P<0.05,**P<0.01 vs AR.

Fig 4 Modulation of resveratrol on ratio of CD4+GATA3+Th2 cells in spleen of allergic rhinitis mice (,n=6)Both the high dose and low dose treatment of resveratrol reduced the ratios of CD4+GATA3+Th2 cells significantly in spleen of allergic rhinitis mice;#P<0.05 vs NC,**P<0.01 vs AR.

3 討論

過敏性鼻炎病理學發(fā)病機制主要涉及鼻黏膜中嗜酸性細胞浸潤、肥大細胞聚集和T細胞活化[11]。Th1和Th2免疫平衡在過敏性鼻炎的發(fā)生中起到重要的調(diào)節(jié)作用，尤其是對Th2型免疫反應[12]。過敏體質(zhì)的患者接觸外源性過敏原時，抗原提呈細胞吞噬抗原，并將抗原進一步加工后，將特異性抗原片段提成給CD4+T細胞，導致T細胞向Th2細胞分化；Th2細胞分泌Th2型細胞因子IL-4和IL-13；其中，IL-4可促進B細胞分化為質(zhì)細胞，并針對特異性抗原產(chǎn)生抗原特異性IgE；IL-13主要活化黏膜組織中嗜酸性粒細胞和肥大細胞。患者再次接觸到過敏原時，抗原特異性IgE同過敏原迅速結(jié)合，導致IgE-FcεRI交聯(lián)，進而引發(fā)肥大細胞脫顆粒，釋放過敏介質(zhì)，破壞黏膜組織細胞，出現(xiàn)黏膜水腫、分泌物增多，產(chǎn)生鼻癢、打噴嚏、流鼻涕等炎癥癥狀，引發(fā)過敏性鼻炎[13-14]。在研究中，白藜蘆醇治療后明顯降低極化的Th2細胞比例，同時逆轉(zhuǎn)了OVA誘導上調(diào)的過敏性鼻炎小鼠血清中IL-4、IL-13和OVA-sIgE的水平，減輕鼻黏膜嗜酸性粒細胞等炎性細胞的浸潤。

Th17細胞和調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell,Treg)的發(fā)現(xiàn)拓展了Th1/Th2平衡學說，進一步加深了對AR免疫學病理機制的了解[15-16]。Th17介導的中性粒細胞炎癥反應在重癥哮喘的作用近年來引起廣泛關注，有相關報道Th17也參與鼻炎的發(fā)病過程[17]。調(diào)節(jié)型T細胞作為機體中一類具有免疫負調(diào)控功能淋巴細胞亞群，對維持機體免疫平衡、調(diào)節(jié)過敏反應具起到重要作用[18]。該研究中，OVA誘導的過敏性鼻炎模型及高、低劑量的白藜蘆醇治療組中，小鼠血清中的Th1型細胞因子IFN-γ、Th17型細胞因子IL-17和Treg型細胞因子IL-10均未表現(xiàn)出顯著差別；白藜蘆醇高劑量治療后，可以逆轉(zhuǎn)卵清蛋白誘導高表達的Th2細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA3和Th2型細胞因子IL-4、IL13的表達水平；上述研究結(jié)果提示，白藜蘆醇主要通過抑制Th2型細胞極化和Th2型細胞因子釋放，調(diào)節(jié)機體免疫，改善過敏鼻炎癥狀。

綜上所述，白藜蘆醇能夠降低卵清蛋白誘導的過敏性鼻炎小鼠脾臟中CD4+GATA3+Th2型T細胞比例，減少Th2型細胞因子IL-4、IL-13的釋放，進而抑制B細胞針對抗原卵清蛋白生成的特異性IgE，抑制肥大細胞脫顆粒釋放過敏和炎癥介質(zhì)，減輕鼻黏膜組織嗜酸性粒細胞浸潤，緩解小鼠過敏性撓鼻和打噴嚏次數(shù)，改善過敏性鼻炎癥狀。