膽鹽水解酶基因的克隆及其在干酪乳桿菌CECT5276中的分泌表達

丁 軻 余祖玲 王鐠蒂 余祖華 李 旺 李元曉 何萬領 曹平華 張春杰 劉 寧

(1.河南科技大學宏翔生物飼料實驗室，洛陽471003；2.洛陽市活載體生物材料與動物疫病防控重點實驗室，洛陽471003)

膽固醇是一種甾體化合物，廣泛存在于動物性食品內，在肝臟、腦、膽汁、蛋等中含量較高。隨著人們生活水平的提高，動物性食品在飲食結構中的比例逐漸上升，導致膽固醇攝入過量，引起血清膽固醇含量增高，從而會引發冠心病、高血壓、高血脂、動脈粥樣硬化等一系列心腦血管疾病，在中老年群體中尤其普遍[1-3]。據調查，當前因疾病死亡的人數中有約40%的疾病是由直接或間接高膽固醇所引起，是人類疾病的第一大殺手[4-5]。降低血清膽固醇含量可有效防止心血管疾病的發生，提高人們的健康指數[6-7]，其有效途徑：一是從源頭控制，即降低食品源中膽固醇的含量，以減少人們對膽固醇的攝入量和攝入機會，二是降低體內的膽固醇含量，即通過干預手段降低血液中膽固醇的含量。降低體內膽固醇含量最有效的方法是使用膽鹽水解酶(BSH)，BSH是微生物生長過程中產生的一種蛋白質代謝產物，具有較強的降解膽固醇的能力[8]。據報道，產生BSH的菌株主要來自于乳酸菌，如植物乳桿菌(L.plantarum)[9-10]、干酪乳桿菌(L.casei)[11]、布氏乳桿菌(L.buchneri)[12]、雙歧桿菌(Bifidobacterium)等[13]。另外，在擬桿菌屬(Bacteroides)和腸球菌屬(Enterococcus)的細菌中也發現有BSH[14-15]。但一般情況下，野生型菌株降解膽固醇的能力均有限，不能完全滿足臨床需要。因此，很有必要利用現代基因工程技術將BSH基因在高效表達系統中進行表達，后期無論其純化酶或基因工程菌均具有極好的應用前景。

本實驗室前期已分離鑒定了1株L.plantarum——L.plantarumDPP8，GenBank登錄號為KR824936，菌種保藏號為CCTCC M2016136，試驗證明其基因組上含有1個975 bp的BSH基因，并可降解培養基中35.93%的膽固醇，降解率有限[16]。為了提高BSH基因的表達量，本試驗擬利用PCR技術克隆BSH基因，將其重組于表達載體pMJ67-sp中，電轉入L.caseiCECT5276中進行表達研究，以期獲得能夠高效表達BSH的重組L.caseiCECT5276，將其開發成為功能性活菌飼料添加劑應用于動物生產，能夠高效降低動物性產品中膽固醇含量，從而為人類提供更為健康的動物性食品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

L.plantarumDPP8，本實驗室分離保存；pMD18-T，購自大連寶生物工程有限公司；表達質粒pMJ67、L.caseiCECT5276由荷蘭Gasper教授贈送；pMJ67-sp，本實驗室構建。

1.1.2 培養基

MRS液體培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，磷酸氫二鉀2 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸二銨2 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，七水硫酸鎂0.58 g，四水硫酸錳0.25 g，瓊脂粉 15 g，水1 000 mL，調pH至6.2～6.4，115 ℃、0.105 MPa滅菌15 min。

降膽固醇培養基：含2%膽固醇的MRS液體培養基。

BSH誘導培養基：含2%牛磺膽酸鈉的MRS液體培養基。

LB液體培養基：胰化蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉5 g，調pH至7.0，121 ℃、0.12 MPa滅菌20 min。

1.1.3 生化試劑及工具酶

聚合酶PyrobestTMDNA Polymerase、DL2000 Marker、λDNA/HindⅢ、限制性切酶NdeⅠ、EcoRⅠ，PCR回收試劑盒、T4 DNA Ligase，IPTG、X-gal、Goldview購自大連寶生物工程有限公司；細菌基因組提取試劑盒、質粒純化試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒等均購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 主要儀器

1.3 方法

1.3.1 引物設計

根據GenBank中已登錄的L.plantarumBSH基因(登錄號：MBUL90)序列，利用Primer Premier 6.0設計1對引物，bsh1：5’-CGCATATGATGTGTACTGCCATAACT-3’(劃線部分為NdeⅠ位點)和bsh2：5’-CGGAATTCGTTAACTGCATAGTATTG-3’(劃線部分為EcoRⅠ位點)，送至上海生物工程股份有限公司合成。

1.3.2L.plantarumDPP8基因組DNA的提取

將培養的L.plantarumDPP8按照天根生化科技(北京)有限公司的細菌基因組DNA提取試劑盒的方法提取其基因組DNA。

1.3.3BSH基因的克隆

以L.plantarumDPP8基因組DNA為模板，利用引物bsh1和bsh2進行擴增，PCR反應體系為：上游引物1.5 μL(20 pmol/L)、下游引物1.5 μL(20 pmol/L、10×PCR Buffer 5μL、dNTPs 1 μL (10 pmol/L)、Pyrobest DNA Polymerase 0.5 μL(5 U/μL)、模板DNA 4 μL，加滅菌超純水至50 μL。反應條件：模板DNA 95 ℃預變性10 min；95 ℃ 40 s、62 ℃ 1 min、72 ℃ 90 s，進行30個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。利用天根生化科技(北京)有限公司的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行PCR產物的回收，然后將擴增產物連接于pMD18-T，得到克隆質粒pMD18-BSH。將驗證正確的質粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，并進行同源性比較，確定是否是BSH基因。

1.3.4 重組表達載體的構建

利用限制性內切酶NdeⅠ和EcoRⅠ分別對鑒定正確的克隆質粒pMD18-BSH與表達載體pMJ67-sp進行雙酶切，分別回收目的條帶，16 ℃條件下經T4連接酶連接過夜，轉化大腸桿菌(E.coli)109，在含有氨芐青霉素的LB固體培養基上篩選陽性菌株。用質粒提取試劑盒提取質粒，采用PCR法、雙酶切及測序進行鑒定，將鑒定正確的質粒命名為pMJ67-sp-BSH。

將100 μL感受態乳酸桿菌與5 μL(300～500 ng) pMJ67-sp-BSH在冰浴下混勻，然后加入到冰浴預冷的0.1 cm的電轉化杯中，冰上放置10 min。在電壓600～1 200 V、電容25 μF、電阻100 Ω條件下進行電擊，電擊后立即加入0.9 mL預冷的含10%蔗糖的MRS，轉入1.5 mL離心管中，37 ℃孵育2 h后，取200 μL涂于含5 μg/mL的紅霉素抗性的MRS平板上，37 ℃厭氧培養40 h。在平板上挑取陽性克隆，采用細菌基因組提取試劑盒提取乳酸桿菌基因組，利用引物bsh1和bsh2參照步驟1.3.3進行PCR鑒定和酶切鑒定，并將擴增后的序列進行測序，鑒定正確的即為重組L.caseiCECT5276——L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)。

1.3.5 重組L.caseiCECT5276 BSH的表達與純化

1)表達產物濃縮：將陽性重組L.caseiCECT5276接種于加有2%牛磺膽酸鈉的MRS液體培養基中，37 ℃厭氧靜置培養至600 nm處吸光度值(OD600 nm)=0.5時加入0.5%的乳糖，誘導培養36 h，將菌液5 000 r/min離心8 min，取上清液。向100 mL上清液中加入150 mL聚乙二醇6000(PEG6000)，攪拌至完全沉淀，5 000 r/min離心10 min，棄上清液，用0.01 mol/L(pH 7.4)的磷酸鹽緩沖液(PBS)懸浮沉淀，4 ℃透析48 h，重復5～6次，4 ℃、10 000 r/min離心20 min，棄沉淀，上清液透析48 h，重復5～6次，于-20 ℃保存備用。

3)鑒定：將濃縮液和純化液于15%的垂直板凝膠中進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，以未誘導的L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)、L.caseiCECT5276(pMJ67-sp)和誘導的L.caseiCECT5276(pMJ67-sp)為對照。

1.3.6L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH) BSH活力測定

將L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)于37 ℃用0.5%的乳糖厭氧誘導培養36 h，離心分離上清和沉淀。后者用PBS(pH 6.0)洗2次后，加冰預冷的PBS，混勻，于冰上用超聲破碎儀破碎細胞后，于4 ℃、5 000 r/min離心10 min，取上清液。分別以上述培養上清液和菌體裂解上清液為粗酶液進行BSH活力測定，同時以野生型菌株L.plantarumDPP8為對照。樣品管和空白對照管分別加入55 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)溶液0.3 mL，0.01 mmol/L巰基乙醇溶液0.3 mL，0.5 mmol/L pH 6.0 PBS 0.3 mL，0.12 mmol/L牛磺膽酸鈉0.1 mL，雙蒸水0.3 mL。將上述溶液用移液槍反復吹打混勻后，置37 ℃恒溫水浴鍋中孵育10 min，向樣品管和空白對照管中分別加入1.5和1.2 mL 15%的三氯乙酸，同時吸取0.2 mL的粗酶液加入樣品管中，徹底混勻后，于4 ℃、1 000 r/min離心10 min，分別吸取0.8 mL樣品管和空白對照管上清液，各加入1.8 mL顯色液(0.3 mL 2%茚三酮-檸檬酸鹽溶液、1.5 mL 30%甘油)，當樣品管和空白對照管與顯色液徹底混勻后，塞上棉塞于水浴鍋中沸水浴15 min，冷卻至常溫，在570 nm處測定吸光度值(OD570 nm)。BSH活力定義為：每分鐘每毫升粗酶液反應產生牛磺酸的微摩爾數。

BSH活力(U/mL)=A×4 000/30。

式中：A表示牛磺酸的微摩爾數。

取0.5 mmol/L的牛磺酸標準液，配制成5個不同濃度的工作液(0.083、0.167、0.250、0.333、0.417 mmol/L)，繪制牛磺酸標準曲線。

1.3.7L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)降膽固醇能力測定

標準曲線的制定：取1.0 mg/mL的膽固醇標準液，配制成5個不同濃度的工作液(20、40、60、80、100 μg/mL)，然后各取1.0 mL參照文獻[17]采用鄰苯二甲醛(OPA)法對膽固醇含量進行測定。以1.0 mL無水乙醇作為空白對照，每個濃度重復測定3次，取平均值。

將L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)接種到MRS培養基中活化后，按2%(體積分數)的接種量接種于10 mL降膽固醇培養基中，37 ℃厭氧靜止培養，每隔12 h搖勻1次，培養48 h后，吸取混勻的菌液1.0 mL，5 000 r/min離心10 min，檢測培養液中膽固醇的殘余量。分別以L.caseiCECT5276 (pMJ67-sp)和L.plantarumDPP8為對照。膽固醇降解率計算公式為：

D(%)=[(A-B)/A]×100。

式中：D為膽固醇降解率；A為未接種菌株培養上清液中膽固醇含量；B為重組干酪乳桿菌發酵后培養上清液中膽固醇含量。

1.4 統計分析

試驗數據采用Excel 2017軟件進行處理，試驗結果以平均值+標準誤表示，并采用Excel 2017軟件進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 BSH基因PCR克隆結果

以L.plantarumDPP8基因組DNA為模板，經PCR擴增后，擴增產物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，結果如圖1所示，在約975 bp處有1條特異性條帶，與預期大小相符。將克隆質粒pMD18-BSH測序，結果表明該基因全長為975 bp。同源性比較顯示該基因與L.plantarumMBUL69的BSH基因同源性高達99.6%。進化樹分析顯示該基因與L.plantarumMBUL69的BSH基因在同一分支。上述結果表明本試驗克隆獲得了L.plantarumDPP8源的BSH基因(GenBank登錄號為：KT343778)。

1和2：PCR擴增產物；3：陰性對照；M：DL2000 Marker。

2.2 表達載體pMJ67-sp-BSH的鑒定及重組L. casei CECT5276的PCR鑒定

將表達載體pMJ67-sp與pMD18-BSH同時用NdeⅠ和EcoRⅠ酶切后進行連接，得到重組表達載體pMJ67-sp-BSH。質粒pMJ67-sp-BSH PCR擴增產物和酶切鑒定結果見圖2，NdeⅠ/EcoRⅠ雙酶切后得到2條分別約為5 000和975 bp的條帶，EcoRⅠ單酶切得到1條約為6 000 bp的條帶，采用引物bsh1/bsh2進行PCR擴增得到1條約為975 bp的條帶，均與預期大小相符，說明重組表達載體pMJ67-sp-BSH構建成功。

M1：DL2000 Marker；1：NdeⅠ/EcoRⅠ雙酶切pMJ67-sp-BSH：2：PCR擴增產物；3：EcoRⅠ單酶切pMJ67-sp-BSH；M2：λDNA/HindⅢ Marker。

表達載體pMJ67-sp-BSH電轉化L.caseiCECT5276，通過紅霉素抗性平板篩選陽性菌株后，利用引物bsh1/bsh2對陽性菌株基因組進行PCR擴增。由圖3可知，L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)能夠擴增出約975 bp的條帶，證明BSH基因已成功整合到了L.caseiCECT5276基因組上。

2.3 BSH表達產物的SDS-PAGE結果

經乳糖誘導后的重組L.caseiCECT5276用15%凝膠進行SDS-PAGE，其結果見圖4。由圖4可知，在泳道1約37 ku處有1條清晰的蛋白條帶，與推測的BSH蛋白分子質量大小相符，說明BSH在L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)中得到了表達。而未誘導的重組L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)和誘導的原始菌株L.caseiCECT5276(pMJ67-sp)在約37 ku處也有淺淡的條帶，說明原始菌株L.caseiCECT5276(pMJ67-sp)和未誘導重組菌株L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)基因組上也能分泌產生類似大小的蛋白，但該蛋白的表達不受乳糖誘導的影響。

1和2：L. casei CECT5276(pMJ67-sp-BSH)PCR擴增產物；3: L.casei CECT5276(pMJ67-sp)PCR擴增產物；M: DL2000 Marker。

1：L. casei CECT5276(pMJ67-sp-BSH)未誘導產物；2：L. casei CECT5276(pMJ67-sp-BSH)誘導產物；3：L. casei CECT5276(pMJ67-sp)未誘導產物；4：L. casei CECT5276(pMJ67-sp)誘導產物；5：純化蛋白；M：標準Marker。

2.4 L. casei CECT5276(pMJ67-sp-BSH)表達產物BSH活力測定結果

L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)經乳糖誘導發酵，采用牛磺酸標準液標定法測定BSH的活力，結果見圖5。由圖5可知，L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)的培養上清液中BSH活力為42.57 U/mL，其細胞裂解液中的BSH活力為4.34 U/mL，說明L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)代謝產生的BSH有90.7%的量全部分泌到了胞外。而野生型菌株L.plantarumDPP8的培養上清液中BSH活力為5.71 U/mL，L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)的培養上清液中BSH活力是野生型菌株L.plantarumDPP8的7.46倍。

1：L. plantarum DPP8培養上清液；2：L. plantarum DPP8細胞裂解液；3：L. casei CECT5276(pMJ67-sp-BSH)培養上清液；4：L. casei CECT5276(pMJ67-sp-BSH)細胞裂解液。

2.5 L. casei CECT5276(pMJ67-sp-BSH)降膽固醇能力測定結果

采用OPA法對發酵的含膽固醇MRS培養基中的膽固醇含量進行測定，結果見表1。由表1可知，野生型菌株L.plantarumDPP8的膽固醇降解率為35.77%，重組菌株L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)的膽固醇降解率為94.43%，說明重組菌株的降膽固醇能力得到了提升。

表1 L. casei CECT5276(pMJ67-sp-BSH)降膽固醇解能力測定結果

3 討 論

BSH是一種能夠專一水解膽酸鹽和甘氨酸鹽等類物質生成氨基酸和非結合態膽酸的蛋白酶，其降低膽固醇的機理是代謝產生的非結合態膽酸能與膽固醇結合形成沉淀，隨糞便排出體外，從而降低介質中的膽固醇含量[18-19]。它常常存在于微生物體內，是由微生物代謝產生的一種酶，尤其是在乳酸桿菌類中最為常見，經常服用乳酸桿菌制劑或酸奶能夠改善血脂調節血流變，這可能就是因為這類產品具有降膽固醇功效的原因[20-21]。本團隊在前期研究中分離獲得了1株產BSH的L.plantarumDPP8[16]，本試驗又成功克隆了其BSH基因。從GenBank中提交的BSH基因的信息分析，BSH基因絕大部分來自于L.plantarum、格氏乳桿菌(L.gasseri)、棒狀乳桿菌(L.coryniformis)、發酵乳桿菌(L.fermentum)、唾液乳桿菌(L.salivarius)等[22]，但這些不同菌株來源的BSH基因差異較大，同源性最低35.7%，最高可達99.6%，所以BSH存在基因多樣性，說明這些不同來源的BSH在關鍵酶活性位點的空間結構是相同或相近的。因此，L.plantarumDPP8BSH基因的克隆豐富了BSH基因庫，對于進一步研究其降膽固醇機制具有重要意義。

目前，關于產BSH的乳酸菌的報道很多，但BSH的體外活力一般均較低[22-23]。本團隊所分離篩選的1株降膽固醇乳酸菌L.plantarumDPP8，其所產BSH的活力僅為5.78 U/mL，對培養基中膽固醇的降解率為35.93%[16]，說明野生型乳酸菌產BSH以及降膽固醇能力均有限。通過基因工程技術利用高效表達系統是實現高產BSH的最有效途徑之一。Yu等[10]將來源于L.plantarumM1-UVS29的BSH基因重組于乳酸乳球菌(L.lactis)NZ9000表達系統，表達的BSH活力為0.77 μmol/min。唐雅茹等[24]將4種BSH基因(BSH1、BSH2、BSH3、BSH4)在L.plantarumKLDS1.0386中進行表達，并證明了不同濃度的不同膽鹽底物均可上調BSH的表達。黃艷娜等[25]同樣也是將4種BSH基因(BSH1、BSH2、BSH3、BSH4)在L. case LC2w中進行表達研究，表達產物中BSH活力分別為85.06、77.75、45.75、46.50 U/mL。本研究所利用的L.case表達系統L.caseiCECT5276(pMJ67-sp)，前期對表達載體pMJ67進行了改造，將短小乳桿菌(L.brevis)1.2028的信號肽基因插入到了pMJ67的啟動子之后，從而能夠實現目的蛋白的分泌表達。試驗結果也驗證了這個載體分泌的有效性，約90.7%的BSH被分泌到了胞外，其活力是野生型菌株L.plantarumDPP8的7.46倍，而且能降解培養基中94.43%的膽固醇，遠遠超出了野生型菌株L.plantarumDPP8 35.77%的膽固醇降解率，說明重組菌株L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)不僅實現了BSH的高效表達，而且所分泌的BSH具有天然的蛋白活性。L.casei本身就是一種益生菌，國際上公認許可用作食品或飼料添加劑，因此重組菌株L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)更具有重要的現實意義，如可用于酸奶發酵可制作功能奶，用于秸稈青貯制作高質量的飼料，或直接將其作為活菌飼料添加劑，這些產品用于人或動物均會使重組菌株L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)及其代謝產生的BSH進入機體內，從而可以降低體內膽固醇的含量，間接達到預防或改善體內脂類的代謝的目的。

4 結 論

本試驗成功克隆了L.plantarumDPP8的BSH基因，并將其重組入了L.casei表達系統L.caseiCECT5276(pMJ67-sp)中，實現了BSH在L.caseiCECT5276中的高效分泌表達，其活力可達42.57 U/mL，并可使培養基中膽固醇的降解率達94.43%。