糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的儲存穩(wěn)定性以及鹽酸濃度對牛奶中糠氨酸檢測結(jié)果的影響

陳美霞 陳沖沖 文 芳 張養(yǎng)東 鄭 楠 王加啟*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶及奶制品質(zhì)量安全控制重點實驗室，北京100193；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(北京)，北京100193；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶及奶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(北京)，北京 100193；4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京100193)

糠氨酸，即ε-N-2-呋喃甲基-L-賴氨酸，又名呋喃素，是美拉德反應(yīng)的系列產(chǎn)物之一。糠氨酸的含量可以直接反映牛奶在加工過程中所經(jīng)歷的熱處理強(qiáng)度，一般而言，牛奶所經(jīng)歷的熱處理強(qiáng)度越強(qiáng)(加熱時間越長或加熱溫度越高)，糠氨酸含量越高；此外，儲存過程中糠氨酸含量也規(guī)律性增加[1]。因此，國內(nèi)外常用糠氨酸含量的變化來評價牛奶加工方式或儲存方式對奶制品質(zhì)量的影響[2-3]。我國已經(jīng)將糠氨酸和乳果糖含量聯(lián)合用于巴氏殺菌乳和超高溫(UHT)滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定[4]。一系列研究發(fā)現(xiàn)，糠氨酸可以抑制HepG2和Hek293細(xì)胞體外生長活力[5-6]，小鼠體內(nèi)試驗證明糠氨酸具有肝臟毒性和腎臟毒性[7]，并可以影響睪丸指數(shù)、血清激素表達(dá)水平和精子質(zhì)量，并對睪丸組織造成病理損害[8]。因此，準(zhǔn)確地、定量地檢測乳制品中糠氨酸含量對于科學(xué)研究和乳制品質(zhì)量監(jiān)管具有重要意義。

目前，糠氨酸含量的檢測方法主要有高效液相色譜(HPLC)法[9-10]、超高效液相色譜(UPLC)法[11]、超高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)(UPLC-MS/MS)法[12]、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜串聯(lián)(CE-MS/MS)法[13]、穩(wěn)定同位素稀釋-質(zhì)譜聯(lián)用法[14]和表面熒光光譜法[15]等。表面熒光光譜法因其靈敏度較低，一般用于半定量分析，因此應(yīng)用范圍有限。CE-MS/MS法雖然分離度較高，但前處理復(fù)雜，不適用于大批量樣品檢測。UPLC-MS/MS法因儀器昂貴、維護(hù)成本高，需要專門人員進(jìn)行操作，也限制了其在實際中的應(yīng)用。目前，對于液態(tài)奶中糠氨酸含量的檢測，國際上主要參照ISO18329中的HPLC法[10]，國內(nèi)主要參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 939—2016中的HPLC法或UPLC法[4]。盡管國內(nèi)外對糠氨酸含量的檢測做了大量的研究，但對該物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性的研究未見報道。了解標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)的穩(wěn)定性，有助于使定量分析過程準(zhǔn)確可靠，對樣品檢測具有十分重要的意義。陳永艷等[16]對抗生素類標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示不同溶劑和溫度條件對抗生素穩(wěn)定性的影響程度不同。周鑫等[17]研究了以甲醇為溶劑介質(zhì)的氯氰菊酯和氟胺氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)長時間跨度和復(fù)雜的溫度條件會增加氯氰菊酯和氟胺氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定的風(fēng)險。因此，研究糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性對于乳及乳制品中糠氨酸定量檢測的準(zhǔn)確性以及乳制品質(zhì)量控制具有重要意義。此外，在參照NY/T 939—2016中規(guī)定的HPLC法或UPLC法[4]對牛奶中糠氨酸含量進(jìn)行檢測時發(fā)現(xiàn)，使用不同批次或不同品牌鹽酸水解相同牛奶時結(jié)果有時存在差異。Guerra-Hernandez等[18]在檢測嬰兒米粉中糠氨酸含量時發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)增加水解米粉時所用鹽酸濃度會提高糠氨酸含量的檢測值。而在參照NY/T 939—2016中規(guī)定的HPLC法或UPLC法[4]對牛奶中糠氨酸含量進(jìn)行檢測時，我們發(fā)現(xiàn)使用不同批次或不同品牌鹽酸水解相同牛奶時結(jié)果有時存在差異，因此，推測不同濃度鹽酸水解牛奶影響牛奶中糠氨酸的檢測結(jié)果。因此，本試驗研究了不同方式配制的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同儲存環(huán)境中的穩(wěn)定性，以期為糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液保存和檢測結(jié)果的可靠性提供一定的依據(jù)；同時，本試驗還研究了使用不同濃度鹽酸水解牛奶對糠氨酸檢測結(jié)果的影響，以期為更準(zhǔn)確地定量檢測乳及乳制品中糠氨酸含量提供科學(xué)數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液(500 mg/L)配制：將糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)品按標(biāo)準(zhǔn)品證書提供的肽純度系數(shù)換算后，用3 mol/L鹽酸配制成標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，-20 ℃下可貯存24個月。

糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：移取2 mL糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液于10 mL容量瓶中，用3 mol/L鹽酸定容，此標(biāo)準(zhǔn)中間溶液濃度為100 mg/L。

糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：移取100 μL糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液于25 mL容量瓶中，用3 mol/L鹽酸液定容，此標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為2.0 mg/L。依上述方法分別配制0.05、0.10、0.50、1.00、2.00和5.00 mg/L的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2 糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液儲存穩(wěn)定性研究

為了研究糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同溫度和不同鹽酸濃度條件下的穩(wěn)定性，本試驗分別用3個濃度的鹽酸(3.0、1.0和0.1 mol/L)配制不同濃度的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(1和5 mg/L)，并保存于不同溫度[-20、4 ℃和室溫(25 ℃)]條件下，分別于第1、3、5、8、10、12、14、15、17和21天對保存的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行糠氨酸含量檢測。每個處理設(shè)3個平行。

1.3 不同濃度鹽酸水解牛奶對糠氨酸檢測結(jié)果的影響

試驗設(shè)置11種不同濃度的鹽酸水解牛奶，每個濃度設(shè)4個平行，分析鹽酸濃度對牛奶中糠氨酸檢測結(jié)果的影響。鹽酸濃度用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液進(jìn)行標(biāo)定，試樣溶液以溴甲酚綠為指示液，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至溶液由黃色變?yōu)樗{(lán)色為終點[19]。選擇連續(xù)的3 d重復(fù)同樣試驗，研究結(jié)果的可重復(fù)性。取1 mL牛奶和11 mL不同濃度的鹽酸(12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2和1 mol/L)于可以密閉的水解管中，密封水解管后放于110 ℃的恒溫干燥箱中，加熱水解24 h(加熱約1 h后輕輕搖動水解管)；加熱結(jié)束后，取出水解管，冷卻后用濾紙過濾，濾液備用。

1.4 水解液中蛋白質(zhì)含量的測定

移取2 mL水解液，參考GB 5009.5—2016[20]中規(guī)定的方法用凱氏定氮儀(Foss，丹麥)對水解液中蛋白質(zhì)含量進(jìn)行檢測。

1.5 糠氨酸含量的測定

穩(wěn)定性試驗中的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液可以直接上機(jī)檢測。測定水解液中的糠氨酸含量時，檢測前需先取1 mL水解液與5 mL 6 g/L乙酸銨溶液混合，過0.22 μm濾膜(Waters公司)后再上機(jī)測定。

水解液中糠氨酸含量參考NY/T 939—2016[4]中規(guī)定的方法利用Waters ACQUITY UPLC H-CLASS UPLC儀(配有紫外檢測器及Empower數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))進(jìn)行定量檢測，方法如下：使用0.1%三氟乙酸水溶液(含6 g/L乙酸銨，流動相A)、甲醇(流動相B)和水(流動相C)為流動相，色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，粒徑1.8 μm)，采用流動相A等度洗脫模式，洗脫速度為0.4 mL/min，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為0.5 μL。定量檢測前需先用流動相B和C沖洗色譜柱，再用流動相A和C流動相平衡色譜柱，最后用3 mol/L鹽酸檢測溶劑純度、儀器和色譜柱的狀態(tài)。上述所用試劑均為色譜純，乙酸銨購于CNW公司，三氟乙酸購于百靈威科技有限公司，甲醇和乙腈購于Thermo Fisher公司。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SAS 9.1.3統(tǒng)計軟件中的單因子方差分析(one-way ANOVA)過程進(jìn)行單因子方差分析，并采用LSD法進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的儲存穩(wěn)定性

2.1.1 鹽酸濃度對糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液儲存穩(wěn)定性的影響

本試驗采用3種不用濃度的鹽酸配制糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，由圖1和圖2可以看出，在相同儲存條件下，用低濃度鹽酸(0.1 mol/L)配制的糠氨酸溶液穩(wěn)定性較差，隨著儲存時間的延長，糠氨酸發(fā)生明顯的降解。根據(jù)糠氨酸的峰面積計算降解率，0.1 mol/L鹽酸配制的1 mg/L糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在25 ℃儲存8 d時降解率達(dá)到23.55%，儲存21 d時降解率達(dá)到84.27%，4 ℃儲存12 d時降解率達(dá)到21.75%，儲存21 d時降解率達(dá)到42.01%，-20 ℃儲存8 d時降解率達(dá)22.75%，儲存21 d時降解率達(dá)59.12%，不能夠滿足試驗要求；0.1 mol/L鹽酸配制的5 mg/L糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液25 ℃儲存14 d時降解率達(dá)到10.15%，儲存21 d時降解率達(dá)到14.18%，4 ℃儲存17 d時降解率達(dá)到10.89%，儲存21 d時降解率達(dá)到12.19%，-20 ℃儲存8 d時降解率達(dá)13.10%，儲存21 d時降解率達(dá)49.39%，不能夠滿足試驗要求；中濃度鹽酸(1.0 mol/L)配制的2種濃度的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(1和5 mg/L)穩(wěn)定性總體比較好，但5 mg/L糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在-20 ℃儲存條件下峰面積波動比較大(18.10%～32.24%)。高濃度鹽酸(3.0 mol/L)配制的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性最好，在-20、4和25 ℃儲存21 d后仍保持穩(wěn)定，滿足試驗要求。考慮到糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在3.0 mol/L鹽酸中穩(wěn)定性最好，因此，建議用3.0 mol/L鹽酸溶解糠氨酸并進(jìn)行儲存。

2.1.2 儲存溫度對糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液儲存穩(wěn)定性的影響

由圖1和圖2可以看出，當(dāng)糠氨酸溶解于高濃度鹽酸(3 mol/L)時，糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性比較好，但溫度并不影響糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性。但是考慮到大批量檢測過程中，UPLC樣品室的溫度一般設(shè)定為4 ℃，同時為了盡可能減少凍融對糠氨酸的影響，因此，配制好的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液不建議保存于室溫和-20 ℃，建議于4 ℃保存，于21 d內(nèi)使用。

2.2 鹽酸濃度對牛奶中糠氨酸檢測結(jié)果的影響

由圖3和表1可以看出，一定范圍內(nèi)，隨著水解牛奶所用鹽酸濃度的升高，糠氨酸的游離程度升高，檢測到的糠氨酸含量增加。統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用的鹽酸濃度達(dá)到10 mol/L時，檢測到的糠氨酸峰面積趨于平穩(wěn)，不再發(fā)生顯著變化(P>0.05)。

為了進(jìn)一步探究上述結(jié)果的可重復(fù)性，選擇連續(xù)的3 d重復(fù)同樣試驗。由圖4和表2可以看出，當(dāng)水解牛奶所用的鹽酸濃度達(dá)到10 mol/L時，牛奶中的糠氨酸可以完全水解游離出來，檢測到的糠氨酸含量不再發(fā)生顯著變化(P>0.05)。

3 討 論

糠氨酸是牛奶在加熱過程中發(fā)生“美拉德反應(yīng)”后的特征性產(chǎn)物之一，其含量可以反映牛奶的質(zhì)量和營養(yǎng)價值[21]。近些年的一系列研究發(fā)現(xiàn)，糠氨酸具有細(xì)胞毒性，并對小鼠肝臟、腎臟和睪丸的正常功能產(chǎn)生負(fù)面影響[5,7,22]。因此，準(zhǔn)確測定牛奶中糠氨酸含量對于牛奶加工過程質(zhì)量控制和科學(xué)研究具有重要意義。

目前基于糠氨酸檢測的研究比較多[9,12,21,23-27]，但是尚未有研究分析糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性。本研究考察了糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同儲存條件下的穩(wěn)定性。試驗發(fā)現(xiàn)，糠氨酸受所處溶液環(huán)境影響比較大，在相同的儲存條件下，糠氨酸溶解在低濃度鹽酸(0.1 mol/L)中穩(wěn)定性較差，在中濃度鹽酸(1.0 mol/L)中穩(wěn)定性較好，在高濃度鹽酸(3.0 mol/L)溶液中穩(wěn)定性最好，這可能是因為糠氨酸本身為酸性分子，較高的酸性環(huán)境有利于其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。與單純的糠氨酸溶液不同，牛奶中糠氨酸則會在儲存過程中會發(fā)生規(guī)律性變化，一般而言，儲存時間越長，儲存時溫度越高，糠氨酸含量會越高，室溫條件下，每10 d每100 g牛奶蛋白質(zhì)中糠氨酸含量約增長7 mg，這主要是因為室溫條件下牛奶中仍然可以發(fā)生緩慢的“美拉德反應(yīng)”產(chǎn)生新的糠氨酸[1]。而在相同的鹽酸濃度(3.0 mol/L)條件下，糠氨酸對溫度不敏感，在-20、4 ℃和室溫(25 ℃)條件下儲存21 d沒有明顯降解，滿足試驗需求。但是考慮到在實際樣品檢測過程中，UPLC樣品室溫度一般設(shè)定為4 ℃，因此建議保存于4 ℃。

此外，本試驗還研究了使用不同濃度鹽酸水解牛奶對糠氨酸檢測結(jié)果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著水解牛奶所用鹽酸濃度的升高，檢測到的糠氨酸含量增加，一方面可能是因為低濃度的鹽酸不能完全水解牛奶使糠氨酸完全游離出來，隨著水解牛奶所用鹽酸濃度的升高，糠氨酸游離程度升高；另一方面也可能是因為低濃度的鹽酸并不能完全阻止新的“美拉德反應(yīng)”產(chǎn)生新的糠氨酸。前人研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)牛奶中鹽酸濃度達(dá)到6 mol/L時，可以完全阻斷“美拉德反應(yīng)”的進(jìn)行[28-29]。本試驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水解液中鹽酸濃度達(dá)到9.17 mol/L時，再提高鹽酸濃度檢測到的糠氨酸含量不再發(fā)生顯著變化，可能是因為這時牛奶中已經(jīng)不再發(fā)生新的“美拉德反應(yīng)”，同時糠氨酸已經(jīng)在鹽酸的作用下完全游離出來。因此，建議水解1 mL牛奶所用的鹽酸濃度至少為10 mol/L，考慮到牛奶稀釋倍數(shù)，即牛奶水解液中鹽酸濃度應(yīng)至少達(dá)到9.17 mol/L。

圖2 不同濃度鹽酸配制的5 mg/L糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同溫度下的儲存穩(wěn)定性

圖3 不同濃度鹽酸水解牛奶對糠氨酸檢測結(jié)果的影響

本試驗通過對糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液儲存穩(wěn)定性進(jìn)行研究，確定了糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的儲存條件，可為實驗室中糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和保存提供參考依據(jù)；同時，本試驗通過對牛奶水解所用鹽酸濃度進(jìn)行研究，確定了牛奶水解液中的鹽酸濃度，可為更加準(zhǔn)確地定量檢測牛奶中糠氨酸含量提供數(shù)據(jù)支持。

4 結(jié) 論

① 糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的儲存穩(wěn)定性受到鹽酸濃度的影響，3.0 mol/L鹽酸配制的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性最佳。

② 糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的儲存穩(wěn)定性受儲存溫度的影響較小，建議將配制好的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液保存于4 ℃，于21 d內(nèi)使用。

③ 鹽酸濃度影響牛奶的水解效果，水解牛奶所用的鹽酸濃度應(yīng)使水解液中鹽酸濃度至少達(dá)到9.17 mol/L。

表1 不同濃度鹽酸水解牛奶對糠氨酸檢測結(jié)果的影響

A、B和C表示在不同的3 d進(jìn)行的3次獨立試驗。每次試驗n=4。

續(xù)表2水解牛奶所用鹽酸濃度HCl concentration used for milk hydrolysis procedure/(mol/L)水解液中鹽酸濃度HCl concentration in hydrolysate/(mol/L)糠氨酸含量Furosine content/(mg/100 g prot) (n=4)12343.6733.55±0.11g40.62±0.40g31.92±0.35g54.5842.16±0.53f48.95±3.60f42.25±0.57f65.5050.52±0.54e49.55±0.94e49.07±0.16e76.4261.78±0.63d62.05±1.05d62.58±1.08d87.3376.68±0.26c76.05±0.46c75.43±0.52c98.2589.56±0.65b89.18±1.88b88.06±0.21b109.17101.98±0.34a101.50±2.64a102.23±0.32a1110.08102.13±0.57a102.62±1.33a103.88±1.97a1211.00109.96±2.70a103.49±1.80a104.70±0.40a