饑餓對眼斑雙鋸魚(Amphiprion ocellaris)幼魚形態性狀與體質量相關性的影響

葉 樂,王海山,楊超杰,陳 治,胡清雨

1 熱帶海洋生物資源利用與保護教育部重點實驗室(海南熱帶海洋學院),三亞 572022 2 海南省熱帶海洋漁業資源保護與利用重點實驗室,三亞 572022

魚類的形態特征信息是魚類重要的分類依據之一,也是魚類育種品種持續改良、利用和保護的前提[1],因此,采集魚類形態特征信息是魚類育種的重要基礎工作。由于體質量是揭示生長性能最直接的指標,因而成為魚類育種中重要的目標性狀,但在實際操作中,特別是對于個體較小的魚類,體質量的測定需要精確的儀器且對操作環境也有比較嚴格的要求,另外,由于體表水分的影響測量誤差較大,所以,尋找更為準確快捷又與體質量密切相關的指標成為許多研究工作的目標。通徑分析可以將基本變量的相關性分解成直接和間接影響,從而更好地理解這些性狀之間關聯的原因[2],為育種指標選取提供更可靠的依據。最近的研究表明,運用多元統計分析和通徑分析,可以闡明菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)[3]、凡納濱對蝦(Penaeusvannamei)[4]、克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)[5]、紅蟹(Charybdisferiata)[6]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[7]、小黃魚(Pseudosciaenapolyactis)[8]、斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)[9]和尖吻鱸(Latescalcarifer)[10]的形態性狀與體質量的相關性,因而可以選擇形態性狀替換體質量指標達到選育的目的。研究表明,魚類形態信息存在著種內差異,與生境[11-12]、性別[13]、生長發育階段[7,14-15]相關。在自然生境中,魚類常受到饑餓的脅迫,因此,饑餓引起魚類生長、組織生理、代謝、行為等方面的影響研究是目前熱點研究領域[16- 18],而饑餓對魚類形態特征影響方面的研究相對匱乏[19]。

眼斑雙鋸魚(Amphiprionocellaris)俗稱公子小丑,是海葵魚亞科(Amphiprioninae)即小丑魚家族的一員,是重要的海水觀賞魚種類之一。小丑魚人工繁殖已經可以量產,但許多研究工作尚待開展,目前國內對于眼斑雙鋸魚的報道僅見胚胎發育[20]、營養[21-22]和藥物應激生理[23]等方面,國外則多聚焦于性轉化[24]、領域行為[25]和熱應激[26]等問題。在小丑魚生產中已經出現種質退化生長緩慢現象,有必要開展快速生長品系的選育工作。由于個體差異和人為因素,養殖過程中某些個體可能會較長時間處于饑餓狀態,目前,饑餓對眼斑雙鋸魚形態性狀與體質量相關性的影響未見報道,是否對選育指標的選擇有影響也尚未可知。因此,本研究通過表型相關的通徑分析,研究饑餓對眼斑雙鋸魚幼魚形態性狀與體質量的相關性影響,旨在評估饑餓和非饑餓狀態下影響眼斑雙鋸魚體質量的主要形態性狀,及其各性狀對體質量的直接作用、間接作用和決定作用,得出兩種狀態下體質量與形態性狀的多元回歸方程,為眼斑雙鋸魚的選擇育種工作提供參考資料、奠定理論基礎,同時為眼斑雙鋸魚生理生態學的研究積累基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與方法

實驗于2019年12月在海南熱帶海洋學院實驗室進行。實驗魚購自海南萬寧小丑魚繁殖場,選取同一批親魚產卵孵化培育的60d健康幼魚,打包充氧帶回實驗室,在實驗室暫養7d后隨機分到實驗養殖缸中。實驗設饑餓組和對照組,每組3個平行,每組30尾。養殖缸為60 cm×40 cm×40 cm玻璃缸,對照組正常投喂,每日投喂2次,饑餓組不投喂,其余養殖條件一致,循環水養殖,每天采用7w全光譜Led燈光照12h,水溫25—26℃。實驗進行7d,實驗結束后全部取樣,然后采用MS- 222麻醉劑進行麻醉后拍照和測量體質量。

1.2 數據測量和分析方法

用吸水紙吸干實驗魚體表水分后用精度為0.001 g的電子天平測量體質量(W,g),接著在體視顯微鏡下對每條魚進行正反面拍照,在電腦上用Image-Pro plus 6.0軟件準確測量每一尾幼魚的形態性狀(mm),包括全長(L1)、體長(L2)、體高(L3)、頭長(L4)、頭高(L5)、吻長(L6)、尾柄長(L7)、尾柄高(L8)、背鰭前距(L9)、胸鰭前距(L10)、腹鰭前距(L11)、臀鰭前距(L12)、眼徑(L13)等13個指標,精確至0.001 mm。

圖1 形態指標測量示意圖 Fig.1 Schematic diagram of morphological index measurementL1：全長,Total length；L2：體長,Standard length；L3：體高,Body depth；L4：頭長,Head length；L5：頭高,Head depth；L6：吻長,Snout length；L7：尾柄長,Caudal-peduncle length；L8：尾柄高,Caudal-peduncle depth；L9：背鰭前距,Pre dorsal length；L10：胸鰭前距,Pre pectoral length；L11：腹鰭前距,Pre pelvic length；L12：臀鰭前距,Pre anal length；L13：眼徑,eye diameter

測量的形態性狀指標如圖1所示,為減少操作誤差,所有樣品魚的形態指標由兩人分別測定,每人對魚體左右側所有指標各測定一次,綜合兩人測定的4組數據取平均值作為最后數值用于統計分析。

運用IBM SPSS statistics 25軟件對數據進行統計分析。計算各性狀的平均值和標準差。各性狀變異系數(CV)的計算公式：

CV=(標準差/平均值)×100%

先對因變量(體質量)進行正態性檢驗,檢驗合格后采用Pearson法對各形態性狀與體質量進行相關分析; 在此基礎上運用逐步引入-剔除法建立形態性狀與體質量的多元線性回歸方程,通過形態性狀對體質量的通徑系數和間接通徑系數,分析各形態性狀對體質量的直接作用和間接作用。

決定系數計算公式：

di=Pi2；dij= 2rij×Pi×Pj

式中,di是單個性狀i對體質量的影響,dij是性狀i和j對體質量的影響,rij是性狀i和j之間的相關系數,Pi,Pj分別是單個性狀i,j對體質量的通徑系數。

2 結果

2.1 數據正態性驗證

對因變量W(體質量)進行正態性檢驗,結果顯示Shapiro-Wilk 顯著性大于0.05,Kolmogorov-Smirnov顯著性為0.200(真顯著性下限),數據服從正態分布,可以對體質量與形態特征進行回歸分析。

2.2 表型數據描述性統計

對眼斑雙鋸魚幼魚體質量和形態性狀數據進行描述性統計,結果見表1。對照組和饑餓組變異系數最大的均為W(體質量)參數(32.651%和34.063),而形態性狀中變異系數最大的是L6(吻長,25.486%和20.689%),最小的是L13(眼徑,8.708%和7.339%)。

表1 表型性狀的描述性統計

2.3 各性狀間的相關性分析

對饑餓組和對照組眼斑雙鋸魚幼魚表型數據進行相關性分析,結果表明,各性狀間均存在顯著相關關系,達到極顯著水平(P<0.01)(表2),說明形態性狀對體質量以及這些性狀之間存在線性相關。對照組形態性狀對體質量相關系數的大小順序(r)為L3>L2>L1>L9>L5>L10>L8>L12>L11>L4>L13>L6>L7,饑餓組形態性狀對體質量相關系數的大小順序(r)為L3>L1>L2>L5>L8>L4>L10>L12>L11>L9>L13>L6>L7。對照組和饑餓組中與體質量相關系數最高的性狀均為體高,而其它形態性狀與體質量相關系數排序兩個組間存在一定的差別。

表2 表型性狀之間的相關性分析及顯著性檢驗

2.4 通徑分析結果

對照組和饑餓組形態性狀對體質量的通徑系數見表3。剔除經共線性診斷共線性嚴重的變量和對體質量影響不顯著的變量,對照組結果保留了L3、L2、L6和L5等4個形態性狀變量,饑餓組結果保留了L3、L12、L2、L7和L6等5個形態性狀變量,所選性狀對體質量的影響達到極顯著水平(P<0.01)。根據成分效應,相關系數可分為直接作用(通徑系數)和間接作用(間接通徑系數)兩部分。對照組直接作用由大到小排序依次為：L3>L2>L6>L5,間接作用排序為：L5>L6>L2>L3；饑餓組直接作用由大到小排序依次為：L3>L2>L12>L6>L7,間接排序為：L7>L12>L2>L6>L3。可見,對照組和饑餓組中體高的直接作用均為最大(分別為0.718和0.574),間接作用均為最小,也是所篩選出的形態性狀中唯一的間接作用小于直接作用的性狀；第二大直接作用均為體長(分別為0.432和0.314)；對照組直接作用最小為頭高(-0.276),對體質量影響呈負向作用,但其間接作用最大(1.184),饑餓組直接作用最小為尾柄長(-0.178),同樣呈負向作用,其間接作用也最大(0.730)。

表3 相關系數分解

2.5 形態性狀對體質量的決定程度

對照組和饑餓組各形態性狀對體質量的決定系數分別見表4。表中,相同性狀對應的數值為其對體質量的單獨決定系數,兩個不同性狀對應的數值為它們對體質量的共同決定系數。從表中可看出,對體質量的單獨決定系數由大到小排序對照組分別為L3>L2>L5>L6,饑餓組為L3>L2>L12>L7>L6,可見,對照組和饑餓組單獨決定系數最大均為體高,其次為體長,單獨決定系數最小均為吻長。對照組和饑餓組共同決定系數最大的均為L3L2,即體高和體長對體質量的共同決定作用最大。共同決定系數最小的對照組為L3L5(體高和頭高)(-0.368),饑餓組為L3L7(體高和尾柄長)(-0.136),均為負向作用。兩組體高的單獨決定系數和與其它性狀共同決定系數總和均為最高,說明不管魚體饑餓狀態如何,體高都是決定體質量最主要的因素。所有單獨決定系數和兩性狀共同決定系數的總和為所篩選性狀的總決定系數,對照組為0.930,饑餓組為0.941。由總決定系數計算剩余因子,對照組e=0.2638,饑餓組e=0.2310,說明兩個實驗組體質量決定因子除了篩選出的上述形態性狀外,還有其它影響較小的因子。

2.6 多元回歸方程構建

通過多元回歸分析,剔除經共線性診斷共線性嚴重的變量和對體質量影響不顯著的變量,分別建立了對照組和饑餓組形態性狀與體質量關系的多元回歸方程：

W=-0.819+0.106L3+0.027L2+0.006L6-0.050L5(R2=0.941,F=267.294,P=0.000)；
W=-0.778+0.078L3+0.016L12+0.015L2-0.055L7+0.018L6(R2=0.930,F=267.294,P=0.000)。

上述回歸方程多重相關系數(R2)均大于0.85,表明所選的形態性狀分別是影響對照組和饑餓組眼斑雙鋸魚幼魚體質量的關鍵因子。F檢驗結果顯示,上述回歸方程的回歸關系均達極顯著水平(P=0.000<0.01)；t檢驗結果顯示,上述回歸方程的形態性狀對體質量的偏回歸系數均達顯著或極顯著水平(P<0.01或(P<0.05) (表5),所以總體回歸方程是顯著的。預測標準殘差平均值及其標準差對照組為0.000±0.967,饑餓組為0.000±0.976,表明建立的多元回歸方程較好的擬合了樣本觀測值。

表4 形態性狀對體質量的決定系數

表5 模型的系數及其t檢驗結果

3 討論

相關性分析表明,所測量的13個眼斑雙鋸魚幼魚形態性狀與體質量均存在極顯著相關關系(P<0.01),顯然,僅用相關分析不能客觀描述性狀間的相互關系,不能把最重要的表型性狀篩選出來。所以為了剔除不必要的指標,有必要進行通徑分析,最終找出影響幼魚體質量的主要關鍵性狀。通徑分析可以將自變量對因變量的總影響分為直接影響和間接影響,并能充分反映性狀之間關聯的原因[2]。一般來說,只有當自變量的表型相關系數達到因變量的顯著水平時,才可以選擇該自變量,否則,應將其排除在外[27]。在通徑分析和決定系數分析中,當相關性狀決定系數的總和(R2)大于或等于0.85時,表明找到主要自變量[28]。本研究未饑餓對照組和饑餓組分別篩選出4和5個形態性狀,它們對體質量總的決定系數均大于0.85,表明眼斑雙鋸魚體質量變異主要是由這些形態性狀決定的,它們分別代表未饑餓和饑餓狀態下直接或間接影響眼斑雙鋸魚體質量的關鍵因子。

本研究發現,饑餓脅迫影響著眼斑雙鋸魚幼魚形態性狀與體質量的相關性,在非饑餓狀態下體高、體長、吻長和頭高等4個形態性狀是決定魚類體質量的主要性狀,而饑餓狀態下體高、臀鰭前距、體長、尾柄長和吻長等5個形態性狀是體質量主要的影響因子。此前研究表明,魚類形態性狀對體質量的影響存在種間差異,如對于二齡草魚(Ctenopharyngodonidellus) 體寬是最主要因素[27]；轉基因鯉則是體長和體高[28]；野生小黃魚體長對體質量的影響最大[8]；而對于 4月齡斜帶石斑魚,全長是最主要因素[9]。種內不同生長階段也存在明顯差異,如6月齡大菱鲆(Scophthalmusmaximus),全長、體高、體厚和頭長對體質量影響最大,而14月齡為全長、體厚和尾柄寬[14]；大瀧六線魚(Hexagrammosotakii)6月齡為體長、頭長、體高和體寬,而18月齡則為全長、體高、尾柄高和體寬[15]。另外,種內形態性狀還表現群體差異和兩性異形,如羅非魚(Oreochromisniloticus)[11]和麗體魚屬的Cichlasomafestae[12]的野生群體和人工養殖群體之間的形態性狀均存在顯著差異；鯰魚(Silurusasotus)和胡子鯰(Clariasfuscus)形態特征存在兩性異形[13],這些種內形態性狀差異對其與體質量的相關性也可能有影響。目前已經證實環境因子對魚類形態性狀有影響,如曾令清等(2017)[29]研究發現鳊幼魚表型特征之間存在關聯,且受環境條件的影響。由于生存環境和人為因素常導致魚類處于饑餓的脅迫狀態,對其能量代謝和行為[18,30]、魚體成分[31]、生理生化[32]、游泳能力[17,33]等產生顯著影響。魚類形態結構與機能是相協調的,因此饑餓狀態下可能存在魚體形態變化適應策略。研究發現,中華倒刺鲃(Spinibarbussinensis)仔魚隨著饑餓程度增加,體長和體高均顯著下降[34],而鯉幼魚饑餓后體高變化較其他參數明顯,導致體高/體長明顯下降,體型變得更加“細長”[19]。這種體型的變化可能是饑餓狀態下肌肉營養物質大量消耗以維持生命造成的,但這種變化也可能有利于降低魚類游泳過程中能量消耗[35],體現了魚類對饑餓脅迫的形態適應。而本研究證實眼斑雙鋸魚幼魚對饑餓脅迫的形態適應,影響了其形態性狀與體質量的相關性,但饑餓和非饑餓狀態下的幼魚也有共同的體質量決定因子,即體高、體長和吻長,其中體高在兩種狀態下都是最主要的決定因子。

為盡可能減少人為誤差,許多形態測量研究取樣的樣本量都比較大,幾百甚至幾千尾,這樣增加了工作量,另外形態測定時間過長難免造成魚類死亡,本研究對常規測量方法做了改進,不采用游標卡尺現場測定,而是在使用麻醉劑麻醉后拍照,再用電腦軟件測量,精確度高,而且對于同一批實驗樣本,采用2人測定正反面數據取平均值再統計,更進一步消除了人為誤差,使得結果更為可信。同時可以減少取樣量,實驗魚在拍照和測量體質量后即可放回水體中,用時極短,很大程度上減少測量操作造成魚類的損傷。

4 結論與建議

本研究應用通徑分析技術探索了饑餓和非饑餓狀態下13個形態性狀之間及其與體質量的相互依賴關系,有助于比較客觀地分析和解釋這些性狀之間的相關模式。研究證實饑餓脅迫影響了眼斑雙鋸魚幼魚形態性狀與體質量的相關性,但饑餓和非饑餓狀態下體高、體長和吻長都是影響體質量的關鍵因子,因此不論眼斑雙鋸魚幼魚饑餓程度如何,可以均選擇它們作為該魚選育快速生長品系的重要參考性狀,當然,這些形態計量性狀應與遺傳研究相結合,提供這些變量與體質量的遺傳力和遺傳相關性的信息。