長江江豚臍帶永生化成纖維細胞系建立及細胞生長特性研究

李 穎 王 丁* 肖武漢*

(1.中國科學院水生生物研究所,武漢 430072;2.中國科學院大學,北京 100049;3.中國科學院水生生物多樣性與保護重點實驗室,武漢 430072)

鯨類作為哺乳動物中極其特殊的一個分支,其生理結構、分子調控機制和進化機制具有重要的研究價值,如鯨類特殊的回聲定位系統,特殊的皮膚和滲透壓調節機制以及潛水適應機制[1]。此外鯨類作為水生態系統的頂端捕食者,對維持食物鏈的完整性和連續性具有重要意義。

長江江豚(Neophocaena phocaenoids asiaeorientalis)隸屬齒鯨亞目鼠海豚科江豚屬,是鼠海豚科唯一的淡水種群,分布于我國長江中下游干流宜昌至上海區段、鄱陽湖、洞庭湖及部分支流[2,3]。從1996年國際自然保護聯盟物種生存委員會(IUCN)紅皮書將長江江豚列為瀕危(EN)物種,到2013年IUCN瀕危物種紅色名錄中的極度瀕危（CR）。隨著人類擾動的持續增強,長江江豚的數量仍在持續下降[4—6],非自然死亡現象頻發,若長江環境得不到改善,種群必將出現更為劇烈的下降,甚至是種群滅絕[7]。對于這種長江珍惜瀕危鯨類,亟待我們采取多種拯救和保護措施,以避免其陷入不可挽回的局面。

鯨豚類營水生生活,活動范圍廣,動物實驗無法開展;同時因倫理、法律等原因,損傷鯨豚類個體的實驗難以開展,這些在一定層面上限制了對鯨豚類生命機制的探索。20世紀70年代,細胞體外培養技術開始蓬勃發展,很多鯨類學者借助細胞培養體外平臺開展鯨類體外培養的相關的研究,包括大翅鯨(Megaptera novaeangliae)、侏儒抹香鯨(Kogia breviceps)、侏虎鯨(Feresa attenuata)、露脊鯨(Eubalaena japonica)和白鯨(Delphinapterus leucas)等[8—12]。體外培養細胞保持了動物個體的細胞和遺傳特性,從某些方面克服了鯨豚類動物活體實驗的限制。在成功分離具有活性的細胞后,借助顯微觀測技術以及分子檢測手段可以開展鯨豚類細胞生物學、分子遺傳學和毒理學等相關研究[13—15]。由于鯨類原代細胞具有難以培養特性,在體外傳代次數有限[16],難以滿足某些實驗要求。SV40T(Simian virus 40 T-antigen)被認為是建立永生化細胞最簡單可靠的基因[17]而被廣泛使用。鯨類學者將其應用到鯨類細胞永生化的實驗中。主要是將攜帶SV40T抗原的質粒轉入鯨豚類細胞,以期獲得穩定的細胞株[18]。

目前長江江豚的研究集中在噪聲、生態學、生理和行為方面[19—22],有關長江江豚細胞層面的研究極少。除了2010和2011年,王京真等[23,24]報道多長江江豚細胞的培養條件和染色體核型外,后續長江江豚的細胞系的研究未見報道。隨著長江江豚全基因測序的完成,長江江豚的研究已經進入了分子生化時代。建立穩定的長江江豚細胞系,便于我們利用影像技術進行形態結構分析,使用分子、生化和免疫技術進行物質變化檢測。建立穩定的長江江豚細胞系也為細胞生理學、細胞免疫學和細胞遺傳學等提供穩定均一的研究樣品,便于后續開展江豚的免疫應答機制和此外,構建穩定長江江豚細胞系,可以更好的將先進分子技術手段運用于長江江豚的疾病治療、飼養繁殖等工作中[25]。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料實驗所用臍帶來于一母豚產子后產下的胎盤。從幼豚產出到胎盤產出約8h,胎盤重約0.72 kg,胎盤上臍帶約為17 cm。

主要試劑和儀器DMEM培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium;Gibco)、胎牛血清(Fetal bovine serum;Hyclone)、青霉素-鏈霉素(Penicillins-Streptomycin;BI)、兩性霉素B(Amphotericin B,BI)、PrimocinTM(InvivoGen)、胰酶(Tripsin-EDTA;Hyclone)、PBS(phosphate-buffered solution,without Ca2+and Mg2+)、CCK-8試劑盒(cell counting kit 8;上海翊圣)、Lipofectamine 3000 Reagent(Invitrogen)和SV40 T antigens(pW2載體;中國科學院水生生物研究所魚類低氧生物學實驗室,武漢）

倒置熒光顯微鏡(徠卡DMi8-電動;Leica)、Spectra Max i3x多功能酶標儀(Spectra Max i3x:Molecular Devices)、CO2恒溫培養箱(Forma Class II Water Jacked CO2Incubator;Thermo)、超凈工作臺(Forma Class II A2 Biological Safety Cabinet;Thermo)和離心機(Centrifuge 5702;Eppendorf)。

1.2 方法

臍帶組織的收集胎盤在長江江豚生產8h后產出,胎盤產出后,使用無菌工具取3份3 cm的臍帶,用終濃度為100 U/mL的雙抗和5.0 μg/mL兩性霉素B的PBS溶液洗滌3次后,浸泡于添加抗生素的PBS中。

長江江豚臍帶細胞的原代培養(1)組織塊培養:將臍帶剪開,使用無菌鑷子剔除臍帶表面的靜脈膜和血塊,使用含100 U/mL青霉素-鏈霉素的PBS溶液多次沖洗,將組織剪成1 mm3左右的方塊,使用15 mL移液管將組織塊均勻分布在10 cm2培養瓶中,滴3滴純胎牛血清,倒置3—4h,再將培養瓶正置并緩緩加入3 mL的完全培養基,完全培養基包含15%FBS、85% DMEM、100 U/mL青霉素-鏈霉素、1×PrimocinTM和5 μg/mL的兩性霉素B。保證組織塊未漂浮,放入37℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱,24h后,加入3 mL培養液(蓋過小的組織塊為準),每隔3d更換一次培養基。(2)胰酶消化法:臍帶切碎后于0.25%胰蛋白酶,37℃攪拌1h,使用70目的過濾網,收集濾后含細胞的懸液,離心,加入含血清的培養基,重懸于培養皿。

細胞傳代當培養的原代細胞匯合到80%—90%時,棄培養基,PBS洗滌,添加2 mL的0.25%的胰酶,于培養箱內消化約10min,待大部分細胞變圓漂浮脫壁,加入4 mL含15%的FBS的DMEM培養基終止消化。用移液器吹打細胞至游離的懸浮細胞,按照1﹕3比例傳入培養皿,繼續培養,等細胞匯合到80%—90%時,進行下一輪傳代。

細胞純化臍帶組織分離出的細胞主要為成纖維細胞和內皮細胞,成纖維細胞和內皮細胞對于胰酶的敏感度存在差異,成纖維細胞易消化漂浮,內皮細胞對胰酶敏感度較差后被消化,成纖維細胞貼壁較快,生長速度較快,3—5次傳代后,即為成纖維細胞。

細胞永生化和鑒定在第5代原代細胞達到70%—80%匯合時,進行轉染實驗。在2個1.5 mL管中分別加入200 μL未添加抗生素以及血清的DMEM培養基,按照DNA﹕轉染試劑為1﹕2的比例進行添加,一管加入pW2-Tt-SV40 T antigens 即包裝SV40 LT antigens(Large T-antigen)和ST(Small T-antigen)的表達質粒20 μg,一管加入轉染試劑Lipofectamine 3000 Reagent 40 μL,5min之后,將兩者混勻,20min之后,將混合液添加到10 cm2培養皿。12h后,更換1/3的培養液,24h后,更換1/3的培養液。36h后,根據細胞狀態進行傳代。并根據已建立的方式[26],進行永生化細胞系中SV40T表達,以原代細胞作為對照,取永生化后15代細胞,提取總RNA,反轉錄得到cDNA,PCR檢測SV40 LT和SV40 ST的表達。使用引物見表1。擴增程序設定為:98℃ 5min預變性;98℃ 15s,58℃ 30s,72℃ 15s,35個循環;72℃延伸5min。

表1 檢測SV40 T antigens的小T抗原和大T抗原區域的引物列表Tab.1 PCR primers used to amplify the ST and LT region of SV40 T antigens

永生化后的細胞凍存與復蘇(1)取第12代、第15代 和第17代匯合度為85%—95%的細胞,吸除培養液,PBS清洗1次,加入2 mL 0.25%胰酶,待細胞懸浮為單個游離細胞,加入2 mL含有血清的培養基,吹勻并移至15 mL離心管,1000 r/min離心5min,棄上清,加入細胞凍存液后重懸細胞,稀釋細胞濃度至5×106個/mL,分裝1 mL至凍存管中,冰上放置30min,-70℃凍存過夜,次日做好相應標記放入液氮保存,利用臺盼藍拒染法[26]對凍存的細胞活性檢測。按照細胞存活率=活細胞/(活細胞+死細胞)×100%,計算細胞存活率。(2)從液氮中取出凍存的細胞,37℃解凍,將凍存細胞移至15 mL離心管中,1000 r/min 離心5min,棄上清,用10 mL含15%胎牛血清的DMEM培養基重懸細胞,置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養。24h后,傳代,利用臺盼藍拒染法對復蘇后的細胞活性檢測。按照細胞存活率=活細胞/(活細胞+死細胞)×100%,計算細胞存活率。

CCK-8(Cell counting kit-8)比色法檢測永生化后的細胞生長曲線取指數生長的長江江豚臍帶細胞接種于96孔板中,每孔100 μL細胞懸液,設置5個重復孔,細胞接種密度為2.5×104cell/mL,每孔加入10 μL CCK試劑,培養箱孵育4h后,利用酶標儀450 nm處測定吸光度(A450),以時間為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制永生化后的長江江豚的細胞生長曲線。

熒光報告基因轉染永生化細胞為了檢驗外源基因在永生化細胞系內的表達情況,接種細胞于免疫熒光專用共聚焦培養皿10 mm培養皿,參照Lipofectamine 3000說明書,在1.5 mL EP管中使用100 μL培養基(Gibco 公司)稀釋2 μL Lipofectamine 3000 Reagent;另一個EP管中使用100 μL未加血清,抗生素的DMEM培養基(Gibco)稀釋1 μg 質粒DNA pEGFP-C1或pERed2-N1。室溫靜置5min后,將兩種溶液混合均勻,制備DNA-脂質體復合物,室溫孵育20min后,均勻滴至細胞培養皿中,利用倒置熒光顯微鏡觀察轉染后24h、48h和60h的熒光表達,并計算轉染效率。

統計學方法對于CCK-8細胞增殖實驗,每組實驗設置5個重復組,使用GraphPad prism7軟件計算每組吸光度的平均值并繪制細胞生長曲線。對于熒光報告基因轉染效率,分別找出3個合適視野,數出白光條件下的細胞數量和激發光條件下發熒光的細胞數量,按照轉染率=陽性細胞數/總細胞數×100%,計算轉染效率。

2 結果

2.1 長江江豚臍帶組織原代培養

(1)15d左右組織塊出現細胞分離,遷出的細胞圍繞組織塊呈放射狀,細胞堆積過多時,傳代。一旦組織塊向外遷移細胞已形成,取出組織塊,轉移到新的培養瓶中,重新接種。接種于培養瓶瓶角的組織塊,細胞向外遷移速度和效率高于培養瓶中部的組織塊。放置一塊酒精消毒的蓋玻片于組織塊邊緣,可加快組織塊的黏附和細胞遷移,10—12d可見細胞遷移。(2)使用0.25%胰酶消化法得到的懸液雜質太多,細胞貼壁少,增加胰酶處理時間,細胞貼壁數量增加,細胞未能傳代。

2.2 長江江豚成纖維細胞的生長特征和形態學觀察

在37℃、5% CO2的培養箱通過原代、傳代培養,獲得純化的長江江豚成纖維細胞。長江江豚細胞接種至培養基0.5h開始貼壁,細胞貼壁較牢,多次沖洗也難以脫落,胰酶處理時間久,貼壁細胞呈鋪石狀,典型的梭形、不規則或多邊形,細胞體積較小,邊界清楚,核仁清晰(圖1)。

2.3 長江江豚臍帶成纖維細胞永生化

利用脂質體轉染法,將SV40 T antigens轉染到長江江豚第三代原代細胞中。10 cm2細胞皿接種不多于2×105cell/mL,pW2-SV40 T antigens質粒為20 μg。轉染SV40 T antigens后,12h后部分細胞死亡,轉入SV40 T antigens的細胞會形成一個細胞灶,生長加速,占據優勢,36h后,可傳代。從細胞傳代和細胞增殖能力可以判斷有部分細胞轉染成功,少量的轉染細胞快速增殖,占據優勢。原代的臍帶細胞繼續傳代培養,細胞生長速度變慢,14代細胞已經老化,死亡,沒法傳代(圖2a)。相比較原代細胞,永生化的細胞生長狀態良好,生長速度明顯加快,體外可穩定傳代40代以上,且增殖能力方面也遠遠高于原代細胞,說明永生化成功。對于快速增殖的細胞系,選取擴增了15代和20代的細胞系,以原代細胞作為對照,通過PCR來進行鑒定,結果顯示:在轉染后的細胞系中檢測到SV40 T antigens的大T和小T抗原區域的表達(圖3),表明SV40 LT antigens已經在細胞中整合。永生化的細胞若未及時傳代,細胞會出現老化和生長衰退(圖2b)。

圖1 長江江豚原代成纖維細胞和永生化細胞(×10物鏡)Fig.1 The primary cultured fibroblasts Yangtze finless porpoise(a)and immortalized fibroblasts(b)(×10 objective)

圖2 長江江豚原代成纖維細胞老化細胞(a)和永生化老化細胞(b)(×10物鏡)Fig.2 The cellular aging of primary cultured fibroblasts Yangtze finless porpoise(a)and immortalized fibroblasts(b)(×10 objective)

2.4 永生化后長江江豚臍帶細胞凍存前及復蘇后的活率

選取永生化后第12代、第15代和第17代江豚成纖維細胞,對凍存前及復蘇后的細胞進行細胞重懸,制備細胞懸液,滴加染料,靜置時間1—2min,計著色細胞數和細胞總數,制表。由表2可知,復蘇24h,細胞凍存復蘇率達到90%,凍存前細胞狀態良好,復蘇之后,細胞狀態良好,活力并未有太大改變,不同代數之間無明顯差異。

2.5 永生化后的細胞生長曲線

將永生化后江豚成纖維細胞按2.5×104cell/mL接種于96孔板連續培養,利用CCK-8法,每12h測量并記錄波長在450 nm處的吸光值,繪制了長江江豚成纖維細胞生長曲線(圖4),永生化的成纖維細胞生長曲線呈“S”型,培養1—2d時,細胞數量沒有較大變化,此時細胞處于潛伏期;培養3d后細胞開始快速生長,此時進入對數生長期;培養6d時細胞生長開始減緩;培養7—8d時,細胞數量基本維持不變,此時細胞生長進入平臺期。

2.6 長江江豚成纖維細胞轉染

利用脂質體Lipofectamine 3000將編碼紅色熒光蛋白的質粒 pERed2-N1和編碼綠色熒光蛋白的質粒pEGFP-C1轉染至長江江豚的臍帶成纖維細胞,檢測外源基因轉染入長江江豚細胞內的基因表達情況。熒光蛋白在細胞核和細胞質中均有穩定表達,細胞核的熒光強度高于細胞質。轉染24h僅有少量的細胞能夠表達熒光蛋白,48h可觀察到較多熒光蛋白,60h可觀察到更高密度和亮度的熒光蛋白(圖5),轉染效率不到15%,這表明長江江豚細胞使用質粒進行基因的過表達效率較低。轉染后的細胞形態較轉染前有所不同,有拉長變細的趨勢,細胞變為圓球狀,懸浮狀,細胞碎片較多,完整細胞核仁明顯。

圖3 PCR檢測SV40 LT和ST基因Fig.3 Detection of SV40 LT and SV40 ST transcript by PCR

表2 長江江豚不同世代成纖維細胞凍存前和復蘇后細胞活率Tab.2 The survival rate before and after cryopreservation of Yangtze finless porpoise fibroblasts at different passages

3 討論

3.1 構建穩定長江江豚細胞系的意義

長江江豚屬于國家級保護動物,因為倫理和法律的原因,對動物機體造成損傷的研究無法開展,生理問題的分子機制仍然知之甚少。細胞是生物體結構和功能的基本單位,在一定培養條件下可視為生命活動的縮影,細胞生物學的先行者Wilson指出:“每一個生物學問題的關鍵最終必然從細胞中尋找”。建立穩定的長江江豚細胞系,便于利用影像技術進行形態結構分析,使用分子、生化、免疫技術進行物質變化檢測,為細胞生理學、細胞免疫學、細胞遺傳學等提供穩定均一的研究樣品。對江豚敏感病毒培養和鑒定,從微觀上對江豚的個體致疾、致危、致死因素及機制的了解提供基礎。此外,構建穩定長江江豚細胞系,可以更好地將先進分子技術手段運用于長江江豚的疾病治療、飼養繁殖等工作中。

3.2 影響長江江豚臍帶原代細胞培養的因素

組織塊培養和酶消化法是目前最常見的體外細胞培養方法[27]。組織塊操作簡便,對細胞傷害較小,但是細胞游離出來易堆積,生長周期長[28];酶消化法操作復雜,但是獲得細胞快速,細胞多單個或成團,很少成片[29],主要包括中性蛋白酶+膠原酶消化法和胰蛋白酶消化兩種方法[30—32]。

圖4 長江江豚臍帶成纖維細胞生長曲線Fig.4 The growth curve of Yangtze finless porpoise fibroblasts

組織貼壁法,除了新鮮組織外,最為關鍵是貼壁方法、時間和組織塊的大小。高效的貼壁方法是組織原代培養成功的關鍵。貼壁方法可采用培養瓶倒置-正置法,將組織塊均勻鋪在培養瓶中,滴1—2滴純的胎牛血清于組織塊,倒置培養瓶,待貼壁后,正置培養皿,添加培養基;貼壁時間過長,組織塊易變質,過短加培養基易漂浮,3—4h即可;組織塊最適大小約1 mm3,鋪盤時組織塊密度需適中。組織類型不同,組織塊游離出細胞的時間不同,大鼠成骨細胞約3d就從組織塊游離[33],驢皮成纖維細胞約15d游離形成原代細胞[34],江豚臍帶成纖維細胞約14d組織附近游離出細胞。

圖5 脂質體介導的pEGFP-C1和pERed2-N1質粒轉染長江江豚永生化細胞(A.比例尺25 μm;B.比例尺75 μm）Fig.5 Liposome-medicated transfection of plasmids pEGFP-C1 and pERed2-N1 intoYangtze finless porpoise fibroblasts(A.Scale bar 25 μm;B.Scale bar 75 μm)

長江江豚的臍帶產出需要6—8h,水中浸泡,導致雜菌污染,原代培養的培養基添加兩性霉素B和PrimocinTM,可提高原代細胞培養的成功率。

3.3 永生化的長江江豚細胞生物學特征

江豚原代成纖維細胞在體外的生長速度,隨著細胞傳代次數的增加明顯延長,細胞出現凋亡,細胞間隙增大。永生化后的成纖維細胞,經多次細胞傳代后細胞形態和狀態相對穩定,但細胞也會出現老化和衰退。

3.4 影響細胞永生化的因素

有限的細胞系,體外多次傳代易發生遺傳性狀的改變,小鼠的胚胎成纖維細胞通常只能良好生長5代,5代之后的細胞急劇衰亡[35]。家兔胚胎成纖維細胞在10代以后出現衰老跡象,胞體平鋪,偽足增多,生長速度慢[36]。臍帶細胞難以培養,一般只能傳2—3代,添加L-谷氨酰胺可讓人的臍帶靜脈細胞傳至6—7代[37]。利用SV40 T antigens,建立可傳代培養25代的人臍靜脈內皮細胞細胞系[38]。對于SV40 T antigens誘發的永生化,SV40 T antigens的用量、質粒的濃度和純度對于轉染是否成功有很重要的意義,合適的用量、高濃度高純度的SV40 T antigens成功概率更大。對于長江江豚細胞系,除脂質體轉染外,可使用磷酸鈣轉染、慢病毒和腺病毒感染等多種方式進行外源基因的過表達或干擾來進行某個基因功能的研究。

鯨類由于物種的特殊性,成功建立的鯨類永生化的細胞系甚少,淡水鯨類細胞系的相關研究更是寥寥無幾,臍帶作為連接母、胎之間的紐帶,對于我們了解母、胎之間的物質運輸具有重要意義,本實驗借助長江江豚分娩時產出的臍帶,成功進行體外培養,并且成功構建了永生化的臍帶成纖維細胞系,驗證了江豚分娩8h后產出的臍帶及胎盤的活性,對長江江豚臍帶的體外培養細胞的生物學特性進行了初步探索,旨在為長江江豚的體外培養建立一些細胞學數據,奠基后續胎盤研究以及臍帶血的研究,為本物種其他組織體外穩定建系打下基礎,僅為其他難以建立的豚類細胞系提供參考。

4 展望

隨著海洋研究的深入,分子和生化技術越來越多的應用到鯨類研究中,構建鯨類穩定的細胞系是必然的發展方向。鯨類作為特殊的二次入水的動物,越來越多的證據表明,鯨類在長期的演化過程中,產生了自己獨特的適應機制。而長江江豚作為特殊的淡水豚類,可能存在一些不同于海洋豚類的適應機制,而對這些適應機制和相關基因的的研究必然要到細胞中去尋找答案。