魚類雙重熒光標記研究
——以中華倒刺鲃幼魚為例

唐 容 呂紅健 付 梅 蘇勝齊 姚維志

(西南大學水產學院,西南大學漁業資源環境研究中心,水產科學重慶市重點實驗室,重慶 400716)

中華倒刺鲃(Spinibarbus sinensisBleeker),隸屬鯉科(Cyprinidae),鲃亞科(Barbinae),倒刺鲃屬(Spinibarbus),俗稱青波。中華倒刺鲃主要分布于長江上游及其主要支流中,是長江上游珍稀特有經濟魚類之一[1]。近年來由于過度捕撈、環境污染、攔河建壩及產卵群體資源量極端匱乏等原因,中華倒刺鲃天然資源量呈逐年下降趨勢[2—4]。因此,為了恢復野生中華倒刺鲃的自然資源量,保護其分布水域的生物多樣性,并進一步促進漁業資源的可持續利用,已開展了多種資源養護措施,例如:設立水生生物自然保護區[5],開展人工培育苗種增殖放流活動[6—11]。據不完全統計,長江中上游每年放流的中華倒刺鲃人工培育幼魚超過40萬尾。為了科學有效的評估中華倒刺鲃的增殖放流效果,掌握中華倒刺鲃的移動分布規律,開展標志放流是重要途徑,而合理的標記方法又是標志放流的前提。

魚類熒光標記技術是采用熒光染料在魚體的鈣質或骨質結構上形成熒光標記的標記技術,作為一種兼具體內和體外標志的標記方法,目前已被廣泛應用于標記軟骨魚類[12]和硬骨魚類[13],該標記技術具有標記費用低,對標記魚的存活、生長和行為影響較小,標記保存率較高,標記易于發現等優點[14,15]。目前國際上經常使用的熒光染料主要有茜素紅S(Alizarin red S,ARS)[16]、茜素絡合物(Alizarin complexone,ALC)[17]、鹽酸四環素(Tetracycline hydrochloride,TCH)[18]和鈣黃綠素(Calcein,CAL)[19]等。此外,熒光標記方法包括直接浸泡[20]、加強滲透[21]、投喂[22]和注射[23]四種。雖然有以上多種可用的熒光染料和標記方法,但熒光標記在魚類上的應用也僅限于使用一種熒光染料對目標魚種進行單一標記,很少有人進行過雙重標記或三重標記研究。此外,當發現多種熒光染料適用于一個魚種,并且在同一研究中有多個該魚種的種群必須標記和區分時,雙重標記或三重標記將特別有用,這樣不僅能增加標記模式(包括單一標記、雙重標記和三重標記等),還能用于區分不同標志放流群體。

本研究采用TCH和ARS對中華倒刺鲃幼魚進行雙重熒光標記,考察不同濃度TCH和ARS雙重標記對中華倒刺鲃幼魚生長和存活的影響,并探討2種熒光染料對中華倒刺鲃幼魚耳石、鱗片、倒刺、鰭條和鰭棘的標記效果,旨在為中華倒刺鲃的標志放流提供潛在的標記技術,并進一步增加魚類熒光標記的標記模式。

1 材料與方法

1.1 中華倒刺鲃實驗幼魚

2016年3月,從重慶靜觀養殖場采集全長為70—80 mm的中華倒刺鲃幼魚約300尾,將幼魚移至200 cm×100 cm(D×H)的圓柱形養殖池中暫養10d,暫養用水為曝氣24h以上的自來水,日換水1次,換水量為10%。暫養期間每天的光照周期為12L﹕12D,且定時投喂兩次浮性顆粒餌料,每次投飼率為魚體重的1%。投喂1h后,測定水質指標,并將水質控制在水溫16.0—17.7℃,pH 6.97—7.23,溶解氧6.91—7.42 mg/L。

1.2 雙重熒光標記染色實驗

先使用TCH對中華倒刺鲃幼魚進行浸染標記,實驗共設6個濃度梯度,即0、100、200、300、400和500 mg/L(表1)。各濃度梯度配制40 L熒光染液,并在配制完成后強曝氣24h,用以提高熒光染液的pH。然后,每個實驗組隨機取40尾中華倒刺鲃幼魚,浸染24h。在浸泡完后,將標記魚放入曝氣自來水中2h,以洗去體表殘留熒光染料。隨后將6個實驗組標記幼魚轉入6個裝有等體積曝氣自來水缸中繼續飼養72h,并統計急性死亡率。最后,將每個實驗組的標記幼魚移入6個200 cm×100 cm(D×H)的圓柱形養殖水槽(養殖水體體積為1400 L,實驗魚養殖密度為0.028尾/L)中飼養30d。此階段為養殖生長實驗的第一階段(圖1),標記幼魚的飼養條件與暫養期間相同。

表1 使用鹽酸四環素和茜素紅S雙重浸泡標記的順序和濃度Tab.1 The order of double immersion marking and concentration sets for TCH and ARS of experimental group

圖1 雙重標記后6個實驗組中華倒刺鲃平均全長(a)和體重(b)Fig.1 Mean total length(a)and body weight(b)of S. sinensis from six experimental groups after double fluorescent marking

在用TCH標記30d后,使用ARS進行相同浸染流程的標記實驗。將先前使用TCH處理的6組中華倒刺鲃幼魚,分別對應使用濃度為0、100、150、200、250和300 mg/L的ARS染液浸染處理24h(表1)。在浸染完成后,統計浸染后72h內ARS二次浸泡標記導致的急性死亡率。

1.3 生長實驗

為了評估兩次浸泡標記后TCH和ARS對中華倒刺鲃幼魚生長和存活的復合效應,從每個處理組中隨機抽取36尾魚,用于隨后持續60d的生長實驗(即生長實驗的第二階段,圖1)。每個實驗組設3個平行組(n=12),分養于200 cm×100 cm(D×H)的圓柱形養殖水槽中(養殖水體體積為1400 L,實驗魚養殖密度為0.028尾/L),整個生長實驗過程中連續充氣,日換水1次,換水率為10%。每天定時投喂兩次浮性顆粒餌料,每次投飼率為魚體重的1%。投喂1h后,測定水質指標,并將水質控制在水溫19.4—25.9℃,pH 7.83—8.51,溶解氧6.76—7.37 mg/L,且光照周期為12L﹕12D。

在生長試驗的第一階段開始時,測量所有實驗魚的全長和體重,數據分別精確到0.1 mm和0.1 g。本研究的養殖實驗共持續90d(第一階段持續30d,第二階段持續60d,在養殖的第30、第60和第90天測定各處理組實驗魚的全長和體重(圖1)。此外,在整個生長試驗過程中記錄每組實驗魚的死亡率。

1.4 標記檢測實驗

在生長實驗結束后,每個平行組取10尾魚(即每個實驗組共30尾),使用200 mg/L的MS-222(tricaine-methanesulfonate)麻醉致死后,取其矢耳石、星耳石、鱗片、倒刺和鰭條(包括背鰭、胸鰭、腹鰭、臀鰭和尾鰭)及鰭棘(包括背鰭、胸鰭、腹鰭和臀鰭)。本研究所取樣本在清洗干凈后在室溫下避光保存,并在取樣20d內完成標記檢測。

使用裝有Leica DFC 495高分辨率數碼相機的Leica DM IL LED熒光顯微鏡和Leica EL6000Comp體式顯微鏡對所取樣品進行熒光標記檢測(表2)。標記效果參照Liu等[24]的方法。將熒光標記清晰度劃分為0至5的6個等級。將標記質量用n表示,當n≥2時,記作可接受標記,即標記質量較好。為保證標記等級劃分的準確,所取樣品需由2名經驗豐富的觀察者獨立觀察分析,如果結果不一致時需由第3位觀察者確定。在鑒定標志效果期間,所有的樣品均未進行打磨和拋光。

表2 用于檢測鹽酸四環素和茜素紅S標記的雙色鏡和濾光片組合Tab.2 Dichromatic mirror and filter combination wavelength for visualizing TCH and ARS marks

1.5 數據處理

應用SPSS 19.0和Excel 2016軟件進行數據統計分析,每尾中華倒刺鲃幼魚的標記質量、全長及體重數據用平均值±標準誤差(Mean±SE)表示。最終采用單因素方差分析法(One-way ANOVA)進行處理組與對照組實驗魚死亡率、全長及體重的差異顯著性分析,設定差異顯著性水平P為0.05,當P≤0.05時為差異顯著。

2 結果

2.1 熒光標記對中華倒刺鲃幼魚存活和生長的影響

在整個實驗中各處理組標記魚與對照組在兩次24h的浸染過程中,及浸染后72h的觀察期間均未出現死亡個體。在90d的養殖實驗期間,6個實驗組也未出現死亡個體,各實驗組之間的死亡率均無顯著性差異(P＞0.05)。經單因素方差分析表明,處理組與對照組在0、30d、60d、90d養殖實驗過程中全長、體重也無顯著性差異(P＞0.05,圖1)。

圖2 TCH和ARS熒光染料對中華倒刺鲃幼魚矢耳石(a)和星耳石(b)的標記質量Fig.2 The mark quality of TCH and ARS fluorochrome dyes on the sagittae(a)and asteriscus(b)of S. sinensis

2.2 內部骨質結構標記效果

在本研究中,經各濃度TCH和ARS標記過的矢耳石(圖2和圖3)和星耳石(圖2和圖4)上均檢測到熒光標記。將TCH和ARS標記過的各內部骨質結構樣品置于熒光顯微鏡下觀察,在藍光照射下有兩種熒光標記,分別是由TCH標記產生的黃色熒光環和由ARS標記產生的紅色熒光環,且黃色熒光環比紅色熒光環更接近于耳石(包括星耳石和矢耳石)的內部(圖3)。而在綠光照射下僅發現ARS標記產生的紅色熒光環,且該紅色熒光環比藍光照射下的更明亮(圖3)。此外,在浸染24h后,較高濃度處理組的矢耳石(≥300 mg/L TCH和≥150 mg/L ARS)和星耳石(≥300 mg/L TCH 和 ≥200 mg/L ARS)中均能檢測到明顯的標記環(n≥2)。結果表明,實驗組Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的矢耳石和星耳石都具有可接受的TCH和ARS標記。

2.3 外部骨質結構標記效果

本研究結果顯示,各對照組魚體的各類外部骨質結構(鱗片、倒刺、鰭條和鰭棘)中均檢測到熒光標記。同上述內部骨質結構結果類似,將TCH和ARS標記過的各外部骨質結構樣品置于熒光顯微鏡下觀察,在藍光照射下有兩種熒光標記,分別是由TCH標記產生的黃色熒光環和由ARS標記產生的紅色熒光環,且黃色熒光環比紅色熒光環更接近于外部骨質結構(包括倒刺、鰭條和鰭棘)的內部。而在綠光照射下僅發現ARS標記產生的紅色熒光環,且該紅色熒光環比藍光照射下的更明亮(圖5、圖6和圖7)。

圖3 不同光源下中華倒刺鲃幼魚矢耳石的雙重熒光標記效果Fig.3 The effect of double fluorescent marking in sagittae of S. sinensis larval observed with different light sources

圖4 不同光源下中華倒刺鲃幼魚星耳石的雙重熒光標記效果Fig.4 The effect of double fluorescent marking in asteriscus of S. sinensis larval observed with different light sources

除100—300 mg/L TCH和100 mg/L ARS處理的側線鱗外,及100—300 mg/L TCH和100、150 mg/L ARS處理的非側線鱗外,在其余幾個處理組的側線鱗和非側線鱗上均能觀察到環形標記,但是這些鱗片的熒光標記效果并不明顯(0≤n≤1,圖8)。

經400—500 mg/L TCH和150—300 mg/L ARS處理的倒刺中可以同時檢測到TCH和ARS的熒光標記(n≥2,圖9)。結果表明,實驗組Ⅴ、Ⅵ的倒刺都具有可接受的TCH和ARS標記(圖9)。

經200—500 mg/L TCH和150—300 mg/L ARS處理的鰭條(包括背鰭、胸鰭、腹鰭、臀鰭和尾鰭),及經300—500 mg/L TCH和200—300 mg/L ARS處理的鰭棘(除ARS濃度為100 mg/L處理后的腹鰭外)中均可以同時檢測到TCH和ARS的標記環(n≥2,圖10和圖11)。結果表明,實驗組Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的鰭條和實驗組Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的鰭棘都具有可接受的TCH和ARS標記。

圖5 不同光源下中華倒刺鲃幼魚倒刺的雙重熒光標記效果Fig.5 The effect of double fluorescent marking in barb of S. sinensis larval observed with different light sources

圖6 不同光源下中華倒刺鲃幼魚背鰭的雙重熒光標記效果Fig.6 The effect of double fluorescent marking in dorsal fin ray of S. sinensis larval observed with different light sources

最后,本研究中所有TCH和ARS雙重浸染處理的耳石、鱗片、倒刺、鰭條和鰭棘中均未觀察到肉眼可見的熒光標記(即n＜4)。

3 討論

3.1 雙重熒光標記對實驗幼魚存活與生長的影響

一般而言,熒光染料對標記動物生長和存活率的影響是衡量標記適用性的一項重要指標[25]。在2次24h浸染標記過程中,72h標記后的觀察期間,及90d的飼養期間各實驗組存活率均為100%,養殖實驗期間處理組與對照組的體重和全長無顯著性差異(P＞0.05),這與采用TCH和ARS浸染標記其他魚類(包括單一標記[26]和雙重標記[27])的研究結果保持一致。但是,Beckman和Schulz[12]研究發現,使用較高的濃度染料或增加對魚類的浸染時間,會導致標記魚的死亡率在浸染期間及浸染后升高,從而降低標記成功率。Liu等[24]認為這些差異不僅是由高濃度染料和長時間浸染造成的,還可能與標記個體處于不同的生命階段有關。本研究結果表明,適宜濃度下TCH(濃度為100—500 mg/L)和ARS(濃度為100—300 mg/L)標記對后續中華倒刺鲃幼魚(全長為70—80 mm)生長和存活均沒有顯著影響。

3.2 雙重熒光標記對不同骨質結構的標記效果與保持率

在熒光顯微鏡下觀察各類骨質結構的標記效果,結果顯示所有處理組側線鱗和非側線鱗的標記效果較差(0≤n≤1),這與劉奇[28]使用ARS對褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)進行標記時,產生的標記效果基本一致。對比相同濃度下矢耳石和星耳石的雙重標記效果,結果顯示矢耳石和星耳石的雙重標記效果差別較小,這與付自東等[29]使用ALC標記胭脂魚(Myxocyprinus asiaticus)耳石和何春林等[30]使用ALC和TCH標記重口裂腹魚(Schizothorax davidi)耳石的研究結論有些出入,這可能與熒光染料種類、標記魚體的生理階段、代謝速度及耳石形態等有關。此外,在較高濃度下浸泡的矢耳石、星耳石、倒刺、鰭條和鰭棘中均能檢測到明顯的標記環(n≥2)。但是在透射光下,所有處理組被觀察的骨質結構中均無肉眼可見的熒光標記(即n＜4),這與Lü等[31]、劉巖等[32]的研究結果不同,Lü等[31]認為要形成肉眼可見的標記需要同時具備高劑量的染料、較長的浸染時間、海水環境及相對穩定的pH等多個條件。在不同物種間產生最佳標記效果所需的染料濃度和浸染時間是不同的。因此,本研究透射光下缺乏可見標記可能是由于魚類物種差異或淡水和海水環境之間的差異造成的。

圖7 不同光源下中華倒刺鲃幼魚背棘的雙重熒光標記效果Fig.7 The effect of double fluorescent marking in dorsal fin spine of S. sinensis larval observed with different light sources

圖8 TCH和ARS熒光染料對中華倒刺鲃幼魚側線鱗(a)和非測線鱗(b)的標記質量Fig.8 The mark quality of TCH and ARS fluorochrome dyes on the lateral line(a)and non-lateral line scales(b)of S. sinensis

圖9 TCH和ARS熒光染料對中華倒刺鲃幼魚倒刺的標記質量Fig.9 The mark quality of TCH and ARS fluorochrome dyes on the barbs of S. sinensis

能否通過標記方法成功地評估魚類的增殖放流效果,關鍵在于是否能保證標記的高保持率,以及在標記過程中和放流后的低死亡率[24]。因此,標記的保留時間是評價標記適用性的另一項重要指標[33]。Bashey[34]認為不同保留時間可能與不同骨質結構、個體代謝差異、標記檢測技術(如打磨、拋光)以及環境因子(如高溫、陽光)等有關。劉巖等[32]使用ARS對黑鯛幼魚進行標記并對其暫養2個月后,發現黑鯛幼魚的硬骨組織仍能保持清晰、肉眼可見的紫色標記。Reinert等[35]研究發現條紋鱸(Morone saxatilis)耳石上的氧四環素(oxytetracycline,OTC)標記可以持續保留3年。本研究結果顯示,在使用TCH標記后的90d(即使用ARS標記后的60d),除部分鱗片外,在其他被分析的骨質結構上形成的熒光標記仍然清晰可見。因此,可以推測,TCH和ARS對中華倒刺鲃幼魚的雙重標記保持時間較長,該標記方法可用于中華倒刺鲃幼魚的標志放流和增殖效果評估,為區分不同標記放流群體提供了一定的技術手段。

圖10 TCH和ARS熒光染料對中華倒刺鲃幼魚背鰭(a)、胸鰭(b)、腹鰭(c)、臀鰭(d)和尾鰭(e)的標記質量Fig.10 The mark quality of TCH and ARS fluorochrome dyes on the dorsal(a),pectoral(b),ventral(c),anal(d)and caudal(e)fin rays of S. sinensis

3.3 雙重熒光標記的可行性和潛在應用

近年來,由于放流的苗種數量多、規模大,往往需要進行大規模的標志放流,熒光染料浸泡標記魚類是其中最常用的方法。該方法不僅能在短時間內實現魚苗的大規模標記,還能最大限度地降低人為操作對魚苗造成的傷害[29]。然而使用這種傳統的熒光染料浸泡標記法來標記魚類,可能難以區分被回捕標記的多個同種魚類的放流群體。因此,對這一標記方法的改進以及對標記模式的創新顯得尤其迫切。本研究結果表明,使用TCH和ARS兩種染料雙重浸泡標記中華倒刺鲃幼魚效果良好。除處理組Ⅱ的側線鱗和處理組Ⅱ、Ⅲ的非側線鱗外(0≤n≤1),所有被分析的骨質結構中均能檢測到熒光標記(n≥2)。TCH標記90d(即使用ARS標記后的60d)后,除部分鱗片外,在其他的骨質結構均具有高的保持率,可見使用TCH和ARS對中華倒刺鲃幼魚進行快速、簡便的雙重熒光標記是可行的?；谝陨辖Y果,可以推測TCH和ARS除了適用于雙重標記中華倒刺鲃外,還可以用于單一標記或三重標記,并且有12種潛在的標記類型,包括單一標記(2種),雙重標記(4種)和三重標記(6種)。Tsukamoto[27]也曾提出當只有一種或兩種熒光染料可用時,雙重標記或三重標記能夠成為魚類標記的新模式,同時還能確定上一次魚體被標記時的大小。

圖11 TCH和ARS熒光染料對中華倒刺鲃幼魚背棘(a)、胸棘(b)、腹棘(c)和臀棘(d)的標記質量Fig.11 The mark quality of TCH and ARS fluorochrome dyes on the dorsal(a),pectoral(b),ventral(c)and anal(d)fin spines fin rays of S. sinensis

3.4 熒光標記的局限性

近年來,熒光染料浸染標記技術已經被廣泛的應用于魚類增殖放流效果評估中。在大多數用于魚類和水生無脊椎動物的增殖放流的熒光標記方案中,僅對放流群體的生長和存活率進行了評估。Tsukamoto[26]指出熒光染料對標記生物體沒有持久不利的影響。即使采用雙重浸染熒光標記,當前研究的結論也支持這一觀點。但是,Bumguardner和King[36]研究發現,使用較高濃度OTC和CAL浸染標記條紋鱸,結果會對其產生較大的毒性。此外,少數研究也已經報道了熒光染料標記具有潛在的不利影響,Meyer等[37]使用ALC對早期生命階段的波羅的海鱈(Gadus morhua)進行批次標記,發現標記物不僅會對鱈存活率產生顯著的急性影響,而且還會對其他重要參數(如生長)具有亞致死作用?；谶@些研究,Lü等[31]推斷熒光染料的毒性跟染料種類、染料濃度、魚的生命階段及環境因子(如溫度)等有關。本研究采用TCH和ARS對中華倒刺鲃進行雙重浸染標記,兩種熒光標記的保留時間分別為90d和60d。對于熒光標記,標記保留時間的延長也意味著相應結構中熒光染料殘留的時間延長。因此,魚類組織中熒光染料的化學殘留物(如鱗片、肌肉、血液、肝臟和腎臟)可能會影響到食品安全。特別是對于一些經濟魚類而言。到目前為止,盡管已經有研究者對魚體內熒光染料的代謝進行檢測,但是關于檢測不同魚類組織中CAL、ALC、ARS、TCH和OTC等熒光染料殘留的文獻報道甚少。綜上所述,在未來的研究中,使用熒光標記前必須先研究熒光染料對目標標記魚的毒性,并進一步量化熒光染料在魚體組織中的代謝速度和殘留量。

綜上所述,TCH和ARS的雙重浸染適用于中華倒刺鲃幼魚的大批量標記,我們推薦把TCH和ARS的單一或雙重浸染作為中華倒刺鲃幼魚的一種標記手段。此外,除部分鱗片以外,熒光染料對倒刺、鰭條和鰭棘的標記效果良好,可以在不殺死標記魚的情況下獲得標記信息,這些標記將會在生物標記實驗或增殖放流標記實驗中發揮重要作用。但是出于對食品安全的考慮,在未來的研究中,使用TCH和ARS標記評估中華倒刺鲃增殖放流的項目成功之前,應先對熒光染料的毒性進行研究,并且需要進一步量化組織中熒光染料的殘留量和研究熒光染料在標記魚體內的代謝情況。