團頭魴TET1基因的表達及對低氧脅迫的響應研究

劉 娟 鄭國棟 陳 杰 鄒曙明

(1.上海海洋大學農業部淡水水產種質資源重點實驗室,上海 201306;2.上海海洋大學農業部團頭魴遺傳育種中心,上海201306;3.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心,上海 201306)

水體中的溶氧水平是生物生存、生長、發育和能量代謝等過程中必不可少的因素。水體中的溶氧含量易受到外界因素(如天氣狀況)影響[1],當水體氧含量不足以滿足魚體正常生存的需求時,魚體就會出現缺氧應激反應[2],缺氧應激會影響魚體生長、發育、繁殖和代謝等方面,長時間的低氧脅迫或脅迫強度過大時,甚至會引起個體死亡[3,4]。

缺氧誘導因子(Hypoxia-inducible factors,HIFs)是缺氧應答反應的主要調控因子,在維持動物體內氧穩態平衡的過程中起著至關重要的作用[5]。在常氧條件下,脯氨酸羥基化酶家族(Prolyl hydroxylases,PHDs)在特定脯氨酸殘基位點羥基化HIF-1和HIF-2,并通過泛素蛋白酶系統迅速使HIF-1和HIF-2蛋白發生降解[6—8]。而在低氧條件下,PHDs的酶活性受到抑制,TET1與PHD2競爭與HIF-2結合,導致PHD2降低HIF-2的羥基化,增強低氧信號轉導通路[9,10]。TET(Ten eleven translocation)1屬于α- 酮戊二酸(alpha-ketoglutaric acid,α-KG)和Fe2+依賴的雙加氧酶大家族,是一種5mC羥基化酶,是DNA去甲基化過程中不可或缺的一種酶[11],在調控胚胎干細胞的發育,腫瘤、血液系統等有重要作用。通過在斑馬魚(Danio rerio)和小鼠(Mus musculus)的研究,肖武漢團隊研究表明,DNA羥甲基化酶基因TET1參與缺氧應答反應,并在缺氧應答反應中有重要作用[9]。Tsai等[12]研究表明,TET1是由低氧誘導因子(HIF-2)調控的。TET1作為HIF-1α的輔助激活物,增強HIF-1的轉錄活性[12]。Chen等[13—15]研究表明,TET1參與了缺氧反應的改變并參與了腫瘤的發生。

團頭魴(Megalobrama amblycephala)是我國重要的淡水養殖經濟魚類,草食性,俗稱武昌魚。團頭魴與其他鯉科魚類相比,具有不耐低氧的特點,在運輸和養殖過程中,容易因缺氧而引起應激反應,甚至死亡,影響了其養殖產量的提高。因此研究缺氧應答相關基因,探究團頭魴缺氧應答基因的相關功能就顯得尤為重要。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用材料均取自上海海洋大學農業部團頭魴遺傳育種中心,受精卵為團頭魴(F4代)卵細胞人工體外受精,將受精卵培養于培養皿(直徑15 cm)約100—120顆,在室溫(22±1)℃,溶氧量(7.0±0.5)mg/L下培養,使用經24h曝氣的自來水,每4—5h換水。每隔4h(0—40h)固定一批胚胎,按照RNA保存液使用說明操作,保存于-80℃至使用。原位雜交所用胚胎去卵膜后于4%磷酸緩沖液4℃、12h,后轉至甲醛中-20℃保存;取體質量為150—160 g的F5代團頭魴暫養在實驗室的塑料水族箱(35 cm×55 cm×45 cm)中,暫養7d,溫度(24.5±1.0)℃、溶氧量(7.0±0.5)mg/L,每2日換水(24h曝氣的自來水)1/3,每日投喂兩次(8:00和16:00),保持自然光照。

1.2 實驗設計與樣品采集

取30尾F5代團頭魴幼魚于3個自動循環系統的水箱(50 L)各10尾,共設2個溶氧水平,低氧處理方法參考Zhang等[16],根據預實驗設其中兩組為低氧組(1.5±0.5)mg/L;對照組(7.0±0.5)mg/L,急性缺氧處理4h,各實驗組隨機取3尾魚,MS-222(100 mg/L)麻醉,取組織(心、肝臟、腦、鰓、肌肉、皮膚、眼睛、腎和脾臟)-80℃保存,而后將缺氧處理組恢復至常氧(7.0±0.5)mg/L,24h后取組織-80℃保存,每個實驗組3個重復。團頭魴極不耐低氧,胚胎在低氧條件下極易死亡,故根據預實驗,胚胎低氧處理組設兩個實驗組,每組200顆胚胎,低氧組(3.5±0.5)mg/L;對照組(7.0±0.5)mg/L,低氧處理6h,低氧處理組在6、12、18、24及30 hpf取樣,放入RNA保存液,對照組也及時在對應的各個發育階段取樣,每組設置3個重復,每個重復200顆胚胎。水體溶氧水平通過氮氣和增氧棒的氣閥通氣大小來控制,并及時用溶氧儀檢測氧含量。

1.3 TET1基因擴增及序列測定

通過與GenBank中預測的多種鯉科魚類TET1 mRNA序列比對,根據根據本實驗室前期獲得的團頭魴轉錄組中已有TET1序列,設計引物F1/R1(表1),以團頭魴腦組織cDNA第一鏈為模板進行PCR,分別擴增獲得TET1基因片段序列。PCR產物經膠回收后連接至pGEM-T載體,篩選獲得陽性克隆送上海生工測序,測序結果經整合確認其為目的條帶。

表1 所用引物序列Tab.1 Primers sequences used in this study

1.4 序列及進化樹分析

利用BioEdit 7.0.0.1、NCBI BLAST等軟件對所得序列比對獲得TET1基因序列。用NCBI BLAST對不同物種的TET1蛋白預測序列進行比較[17]。用Clustal X1.81同源比對蛋白序列,Phyre2、Pymol軟件預測TET1蛋白的二級結構[18]。MEGA 6.06構建TET1系統發育進化樹[19]。

1.5 整胚原位雜交(WISH)分析

根據原位雜交探針的設計原則,探針的引物(表1),用Primer5.0軟件在ORF與3′UTR之間設計探針引物(700—1000 bp),進行常規TA克隆,送測,將質粒用內切酶進行單酶切,酶切產物作為模板進行體外轉錄,體外轉錄使用的地高辛作為標記[20]。

原位雜交實驗[21]主要包括胚胎賦水、蛋白酶K處理、固定胚胎、去除固定、預雜交和雜交,然后探針的去除洗滌和抗體血清的封閉及抗體血清的去除、洗滌胚胎、羅氏BM染料顯色和拍照等關鍵步驟。

1.6 熒光定量(qRT-PCR)分析

實時定量PCR使用PCR熒光定量儀(BioRad,Hercules,CA,USA),以18S[21]為內參基因,引物序列(表1),Mix使用SYBR Green Premix ExTaq(TaKaRa)。所得數據以Mean±SE的形式表示,用SPSS進行單因素方差法分析。

2 結果

2.1 團頭魴TET1基因的序列分析

團頭魴TET1基因全長為5526 bp,編碼1841個氨基酸,通過Phyre2、Pymol軟件模擬預測TET1蛋白二級結構,將團頭魴TET1與人類TET1、斑馬魚TET1對比,發現人類、斑馬魚與團頭魴TET1二級結構相似,都主要包括無規則卷曲及α螺旋(圖1)。

通過MEGA 6.06軟件構建系統發育樹分析表明,TET1與對應的物種聚合度良好,團頭魴的TET1基因與無脊椎動物的TET1基因聚為一支,而人類、小鼠、虎鯨等脊椎動物聚為一支。在魚類分支中,團頭魴的TET1與金線鲃、露斯塔野鯪和斑馬魚聚為一個小分支(圖2)。

圖1 人類、斑馬魚及團頭魴TET1二級結構預測Fig.1 The predicted secondary structure of TET1 in human,zebrafish and blunt snout bream

圖2 團頭魴TET1基因序列構建的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of blunt snout bream TET1 sequences in vertebrates

2.2 TET1在胚胎和組織中的表達模式

整胚原位雜交結果顯示,TET1基因在12 hpf時在頭部檢測到相對較弱信號(圖3b),在24和36 hpf胚胎時期,TET1基因主要在頭部強烈表達(圖3d和3f);qRT-PCR檢測結果顯示,團頭魴TET1基因從受精卵開始就有表達,隨著胚胎不斷發育它們的表達水平明顯的提高,在20 hpf處顯著升高,并在20—44 hpf都維持在一個較高水平(圖4a),這與原位雜交結果基本一致。如圖4b所示,團頭魴TET1廣泛表達于各個組織中,并在腦組織中高度表達,在肝、心和鰓組織中表達相對較低。

2.3 TET1在胚胎和組織中的低氧表達分析

通過qRT-PCR檢測急性低氧脅迫處理團頭魴各組織中TET1的表達量,結果顯示在低氧脅迫下,TET1基因在鰓、肝臟、心和脾組織中極顯著地升高(P＜0.01),但在腦、皮膚、眼和腎臟中顯著地降低(P＜0.01),氧含量恢復24h后,各個組織均有恢復的趨勢,但大多尚未恢復到正常表達水平(圖5)。胚胎低氧脅迫的檢測結果顯示,低氧處理組胚胎TET1基因相對表達量明顯高于對照組(圖6),尤其在24 hpf低氧處理組的表達量極顯著地高于對照組(P＜0.001)。

3 討論

團頭魴是一種不耐低氧的經濟養殖魚類。本研究中對團頭魴TET1的序列結構進行了分析研究,TET1序列比對及結構分析結果顯示團頭魴TET1在3′ 端催化結構域高度保守,包括富含半胱氨酸區域(Cys-rich domain)和DSBH結構域,兩者構成具有雙加氧酶活性的結構。DSBH結構域包含3個保守的鐵離子結合區和1個酮戊二酸結合區(2-oxoglutarate(2OG)-Fe(II)-dependent dioxygenases),參與將5mC羥化為5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hmC)、5-甲酰基胞嘧啶(5-formylcytosine,5fC)、5-羧甲基胞嘧啶(5-carboxylcytosine,5caC)的主動去甲基化過程。另外,我們發現人類TET家族3′ 端都具有保守的催化結構域,這種結構可能決定了TET家族都具有催化5mC羥基化的酶活性。TET15′端有典型的CXXC zinc finger domain,CXXC結構域能增強對DNA CpG島(富含胞嘧啶(C)和鳥嘌呤(G)的DNA區域)的定向結合能力,從而完成主動去甲基化的過程。二級結構預測結果顯示,團頭魴與人類、斑馬魚的TET1結構相似,說明團頭魴TET1基因在長期進化過程中具有高度的保守性。進化樹分析結果顯示團頭魴TET1與其他硬骨魚類具有良好的聚類關系,這些結果說明團頭魴TET1是硬骨魚特異基因組復制產生。TET1基因保守的功能性結構域和氨基酸序列暗示著在進化過程中可能具有保守的生物學功能。

圖3 團頭魴TET1基因各時期的原位雜交結果Fig.3 Whole-mount embryo in situ hybridization analysis of blunt snout bream TET1 mRNAs

葛亮[22]在斑馬魚中的研究發現,斑馬魚TET1基因在22 hpf及36 hpf主要在頭部表達。與在斑馬魚中研究相符,我們的研究結果顯示,團頭魴TET1基因在早期表達相對微弱,中期和后期表達信號顯著增強,都主要在頭部表達。團頭魴TET1基因從受精卵開始就有表達,隨著胚胎不斷發育它們的表達水平有顯著的提高但有一定的波動性,與原位雜交結果基本一致。這表明TET1可能參與胚胎發育過程,并在胚胎發育過程起著重要作用。有研究表明TET1在小鼠ES細胞的維持和囊胚期內細胞團特化相關[23,24]。團頭魴TET1基因在各個組織都有廣泛的表達,并在腦組織中高度表達,這與在小鼠中的研究相吻合。Kriaucionis和Heintz[25]的研究發現,5hmC在小鼠腦組織高度分布。也有研究表明,TET1對小鼠腦部神經元的發育有重要相關性[26,27]。另外,我們發現除腦組織外,TET1基因在脾和腎等重要組織中也高度表達。

圖4 團頭魴TET1基因在胚胎各時期(a)及成魚各組織(b)的熒光定量表達分析Fig.4 qRT-PCR analysis of blunt snout bream TET1 mRNAs levels during embryogenesis(a)and in adult tissues(b)

圖5 TET1基因在各組織中的低氧轉錄響應Fig.5 The effect of hypoxia on blunt snout bream TET1 mRNAs in juvenile tissues*表示顯著性(P＜0.01)

氧含量對生物體的生存與生長至關重要,氧含量易受天氣等的影響而發生變化,生活在氧含量易變化的魚類在進化過程中發展出適應低氧的復雜機制[28,29],在適應低氧應激的過程中,低氧應答相關基因的表達水平會發生變化[16,30]。在斑馬魚缺氧脅迫實驗中,發現低氧條件下誘導了TET1的mRNA水平,引起5hmC水平增高[9]。本研究發現,團頭魴TET1基因在低氧脅迫環境處理的胚胎中顯著的誘導表達,此結果表明,團頭魴胚胎期的TET1基因可以受到低氧脅迫的誘導。在幼魚的急性低氧脅迫實驗中,我們發現團頭魴TET1基因在鰓、肝和脾等組織中表達顯著上調,在腦和皮等組織中表達顯著下調,這可能暗示著TET1基因在低氧應答有重要作用。另外,我們發現隨著溶氧的恢復鰓、脾和肝等組織中TET1的表達量并沒有恢復到正常水平,說明24h恢復期不足以讓團頭魴TET1基因在低氧脅迫中完全恢復。Jing等[9]的研究發現,與野生型相比,TET1敲除魚對低氧更為敏感。根據在低氧脅迫下胚胎及組織中這些表達特征可以推斷團頭魴TET1基因可能參與低氧脅迫響應,進而增強其對低氧的適應性。

4 結論

本文主要探究了團頭魴TET1的功能結構和胚胎各時期的時空表達模式,及在低氧應激條件下胚胎及幼魚各組織中的差異表達分析。我們認為低氧脅迫下TET1基因的差異表達暗示這可能是一種潛在的低氧調控機制,需要我們進一步挖掘探究。本研究主要為TET1基因的功能探究提供參考依據,為參與低氧應答機制的研究提供了新的線索。

圖6 TET1基因胚胎發育各時期的低氧轉錄響應Fig.6 The effect of hypoxia on blunt snout bream TET1 mRNAs during embryogenesis