虹鱒spindlin基因克隆及不同倍性的表達分析

史秀蘭 黃天晴 徐革鋒 鄒作宇 谷 偉 程 琳 劉晨斌 王炳謙

(1.上海海洋大學,上海 201306;2.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所,哈爾濱 150076;3.哈爾濱市農業科學院,哈爾濱 150028)

卵母細胞成熟是胚胎發育的開端。成熟期可以進一步分為兩個方面,即細胞質成熟和細胞核成熟,其中核成熟包括在減數分裂過程中,染色體的聯會,重組和分離[1,2]。spindlin(Spin)基因在前期的研究中被證明是減數分裂紡錘體相關的母體效應因子,且從卵母細胞到早期胚胎發育的過渡期間,在細胞周期調節中發揮作用[3]。作為豐富的母體轉錄物,在小鼠(Mus musculus)[4]、雞(Gallus gallus)[5]和銀鯽(Carassius auratus gibelio)[6]等不同物種的研究中發現,spindlin基因的轉錄和翻譯結果表現出很大差異。在小鼠卵母細胞的減數分裂期間,spindlin部分定位于減數分裂紡錘體[7],而雞在整個有絲分裂期間都停留在染色體上,推斷spindlin可能在間期細胞核中發揮作用,并在有絲分裂期間作為載體轉移到染色體上。蛋白質磷酸化和去磷酸化可調控細胞周期進程[8],有研究表明,Spin家族蛋白在細胞周期中以劑量依賴性方式被磷酸化,在核內發揮重要功能,并且在減數分裂進程中與紡錘體相關[9],在人(Homo sapiens)[10]、小鼠和雞的Spin蛋白家族中,蛋白激酶C(PKC)磷酸化和酪氨酸磷酸化這兩個潛在位點和RNA結合基序RNP-1是完全保守的,RNA結合蛋白調節母體轉錄物的及時翻譯和定位[11]。

通過人工誘導,精子入卵時,使停滯在第二次減數分裂中期的卵子重新啟動,此時利用理化手段抑制第二極體的排出,即制得三倍體雌性虹鱒[12]。在生產過程中,三倍體雌性虹鱒生長速度快、肉質鮮嫩[13]和養殖死亡率小的優勢是二倍體虹鱒不可比擬的,并且逐漸受到市場的親睞。但是三倍體虹鱒性腺敗育的深層機理方面的研究并不詳盡。了解性腺敗育的機制是育種的關鍵,人工誘導的三倍體虹鱒恰成為研究多倍體魚類性腺發育的良好模型。在前期的研究中發現,三倍體雌性虹鱒在8月齡以后,卵母細胞成熟開始受阻,不能正常產生配子。當發育到10月齡后,完整的卵母細胞結構幾乎不存在,由于卵母細胞結構發育異常,染色質集中在核中央或偏于一側,即發生破裂或壞死等敗育現象[14,15]。spindlin基因在脊椎動物如銀鯽、青鳉(Oryzias latipes)[16]和青黑斑河豚(Tetraodon nigroviridis)[17]等進行過相關研究,但在虹鱒的研究中尚未見報道。為深層探究在卵母細胞敗育過程中減數分裂機制中的差異表現,本研究選取240—330 dpf發育時期,采用基因克隆得到spindlin基因cDNA序列,分析了spindlin基因在虹鱒各組織的表達情況,并且比較了spindlin基因在不同發育階段二倍體與三倍體雌性虹鱒卵巢中的表達差異狀況。利用免疫組化方法,觀察在不同發育時期,Spin蛋白在二倍體與三倍體的卵巢組織中表達的動態變化。研究結果為進一步探討多倍體魚類性腺發育過程中減數分裂受阻提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與樣品保存

二倍體和三倍體雌性虹鱒取自黑龍江水產研究所渤海冷水性魚試驗站,在平均水溫為 9℃的養殖缸中飼養,自240—330 dpf期間,每30d取樣1次,共采取全雌二倍體虹鱒48尾,三倍體雌性虹鱒36尾。其中采取3尾二倍體虹鱒的腎、肝、鰓、肌、腸、脾、卵巢、心和眼組織,采取體積大小為3 mm×3 mm;另取二倍體與三倍體虹鱒各6尾的卵巢組織,將所得組織均置于RNA保護液中,并放入-80℃冰箱保存備用。同時采取二倍體與三倍體虹鱒各3尾的卵巢組織,采取卵巢組織時,保持其形態完好度,即前部的扁三棱狀與后部線狀拖尾,并展平置于4%多聚甲醛,常溫備用。

1.2 總RNA提取與cDNA合成

利用Simply P Total RNA Extraction Kit試劑盒(BioFlux,中國)提取總RNA,通過1%瓊脂糖凝膠電泳以及紫外分光光度計檢驗 RNA 的完整度,同時使用ScanDrop 核酸分析儀(Analytik Jena,德國)測量 RNA 濃度和純度,即吸光度值A260/280在1.8—2.0可以留作備用。按照Bio RT高靈敏cDNA第一鏈合成試劑盒(BOER,中國)說明書合成cDNA,其反應體系為5 μL Hybrid mix,0.5 μL Enzyme mix,根據所測得的RNA濃度添加模板量(1 pg—2 μg),加入Nuclease-free water補至10 μL。反應程序為37℃,20min;98℃,5min。獲得的cDNA置于-20℃保存。

1.3 spindlin基因cDNA克隆

在NCBI公共數據庫中檢索到與虹鱒同源性較高的物種spindlin基因的序列信息,根據高度保守區域設計引物,引物spindlinF2/R2用于該基因的核心片段克隆,其5′UTR由設計的引物spindlinF1/R1獲得,引物spindlinF3/R3用于克隆3′UTR,使用Primer 5.0軟件設計特異性引物(表1),引物在蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成。核心片段的PCR擴增體系為10 μL,反應體系為5 μL 2×Taqmixture、0.5 μL Forward primer+Reverse primer、1 μL cDNA、3.5 μL Nuclease-free water。反應程序設置為94℃預變性2min;94℃變性30s;59℃退火30s;72℃延伸30s;30個循環;72℃延伸5 min。根據SMARTer?RACE 5′/3′ Kit Components說明書的方法和步驟進行3′UTR和5′ UTR的RACE擴增,PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳,根據Biospin Gel Extraction Kit(Bio-Flux公司)純化目的片段,PMD18-T載體連接,轉入DH5α感受態細胞,LB培養基(含氨芐)挑取圓形亮白色單菌落送公司完成測序。

表1 虹鱒spindlin基因序列擴增引物信息Tab.1 The primers used for spindlin amplification

1.4 虹鱒spindlin基因序列生物信息學分析

利用DNAMAN軟件拼接克隆片段,得到spind-lin基因完整cDNA,采用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)進行基因開放閱讀框預測,用Blast在線程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析基因與其他物種的同源性。使用DNAMAN6.0軟件對序列進行翻譯及與其他物種同一蛋白的氨基酸序列多重比對。蛋白質基本物理化學參數分析和結構使用在線網站(https://web.expasy.org/protparam/)進行分析,構建氨基酸系統進化樹用MEGA 7.0軟件的鄰接法(Neighbor-joining,NJ)發育樹構建工具,進行1000 次自展檢驗(Bootstrap)評估進化樹分支可信度。

1.5 實時熒光定量PCR

以各時期采取的二倍體和三倍體雌性虹鱒的腎、肝、鰓、肌、腸等組織和卵巢的cDNA 作為實時熒光定量(RT-PCR)的模板,根據已經克隆出的虹鱒spindlin基因序列,以β-actin作為內參基因,使用Primer 5.0軟件設計特異性引物(表1),在蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成。反應體系采用Roche公司(瑞士)的SYBR Green Master 10 μL體系,SYBR Green 5 μL,上下游引物共 0.4 μL,cDNA模板0.5 μL,加ddH2O至10 μL。利用 BIO-RAD CFX96 TOUCH熒光定量儀的 2-ΔΔCt法檢測spindlin基因在各組織以及不同時期卵巢的相對表達量。反應設置程序為95℃,10min;95℃,10s;60℃,30s;共計40個循環,熔解曲線從 65℃上升到95℃,每秒增加0.5℃。

1.6 Western blot

將采取的二倍體和三倍體雌性虹鱒各時期卵巢組織剪切成細小碎塊并勻漿,按照每100 mg組織加入1 mL RIPA裂解液(Beyotime,中國)和10 μL PMSF(Beyotime,中國),在冰上使其充分裂解。12000 r/min離心5min 后,取上清放入新的EP管。按照1﹕5加入蛋白上樣緩沖液,煮沸10min,即獲得各時期卵巢蛋白,保存于-20℃待用。將各時期蛋白樣品進行 SDS-PAGE 凝膠電泳,根據蛋白marker,切下含有目的條帶的下層分離膠,采用 PVDF膜進行轉膜。轉膜時需定流 I=200 mA,時間為50min。然后在5%的脫脂乳中封閉2h。用 PBST洗膜,共3次,每次10min。以Spin的抗兔多克隆抗體為一抗(Immunoway,美國),按1﹕1000比例稀釋在4℃過夜孵育,之后用 PBST 洗膜三次。使用辣根過氧化物酶標記的(HRP)二抗(抗兔IgG,Immunoway,美國)用孵育液1﹕2000倍稀釋,37℃孵育2h,之后利用 PBST洗膜3次。使用 1 mL ECL 超敏發光液(500 μL A+500 μL B)滴到膜上進行顯影,利用化學發光凝膠成像系統(BIO-RAD公司)進行曝光和拍照。

1.7 利用免疫組織化學方法進行切片觀察

采取各時期二倍體與三倍體雌性虹鱒卵巢組織,置于4%多聚甲醛中固定48h,然后從50%、70%、80%、85%、90%、95%和100%的乙醇依次進行梯度脫水,二甲苯透明,置于硬軟蠟中包埋后,以5 μm厚度切片制成石蠟切片,后進行脫蠟,在室溫環境下,將切片避光浸入3%過氧化氫(蒸餾水稀釋)10min,以滅活內源性過氧化氫酶,使用EDTA溶液進行抗原修復,在85℃下浸泡2min,在60℃下浸泡4min。以Spin抗兔多克隆抗體為一抗(Immunoway,美國),按1﹕200比例稀釋在4℃過夜孵育,后用酶標山羊抗兔IgG聚合物(中杉金橋公司)為二抗進行孵育,DAB顯色,蘇木素復染,最后用中性樹膠封片,使用OLYMPUS CX41的正置光學顯微鏡在物鏡40×和目鏡10×鏡頭下觀察,利用IC Capture 2.2軟件獲取圖片。

1.8 數據分析與統計

使用SPSS 17軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan檢驗進行數據處理,利用Origin 2017軟件對統計結果進行作圖,P＜0.01表示具有極顯著差異性,P＜0.05表示具有顯著差異性。

2 結果

2.1 虹鱒spindlin序列分析與多序列比對

本研究通過克隆得到虹鱒spindlin基因cDNA全長4529 bp,獲得GenBank登錄號:MN378564,其中3′UTR長3662 bp,5′UTR長141 bp,開放閱讀框(ORF)長726 bp,編碼241個氨基酸。通過對其編碼的蛋白質進行分析,虹鱒Spin蛋白質的相對分子量為28.3 kD,理論等電點值為5.94,不穩定指數為43.08,此蛋白為不穩定蛋白。

采用Ensembl和NCBI數據庫對spindlin全長cDNA 序列進行分析,得到虹鱒spindlin基因的結構圖(圖1)。通過比對發現虹鱒spindlin位于虹鱒第28號染色體,基因全長約13.5 kb,由7個外顯子和6個內含子組成。利用ExPASy在線分析工具,預測結果顯示該基因無信號肽,無跨膜螺旋區,對虹鱒spindlin基因的磷酸化位點進行預測,結果表明,含有絲氨酸(Ser)磷酸化位點13個[unsp(6/14/15/19/21/22/24/25/27/28)、DNAPK(66)、PKA(90)、PKC(224)],蘇氨酸(Thr)磷酸化位點7個[PKC(51/56/150/205)、unsp(96/193)、PKG(212)],絡氨酸磷酸化位點4個[unsp(2/72/166/203)],Ser-6的得分最高為0.997。

利用BLAST 在線分析軟件對虹鱒Spin氨基酸與其他物種Spin氨基酸進行同源性比對,在硬骨魚類中,虹鱒與銀大馬哈魚(Oncorhynchus kisutch)同源最高,為99.59%,與銀鯽(Carassius auratus)、鯉(Cyprinus carpio)和斑馬魚(Danio rerio)相比分別為87.11%、92.12%和91.7%。與哺乳動物和兩棲動物相比,與雞(Gallus gallus)、小鼠(Mus musculus)、人(Homo sapiens)和兔(Oryctolagus cuniculus)的同源性分別為65.26%、65.05%、61.18%和59.76%。與兩棲動物非洲爪蟾(Xenopus laevis)的同源性為60.16%。

圖1 虹鱒 spindlin 基因結構圖Fig.1 Rainbow trout spindlin gene structure map

2.2 Spin系統進化樹分析

利用貝葉斯分析的方法對21個物種的氨基酸序列進行進化分析,系統發育進化樹顯示,主要分為兩大支,硬骨魚類與哺乳動物類。從分支長度來看,虹鱒與大馬哈魚親緣關系最近,其次就是紅點鮭(Salvelinus alpinus),聚為一支。與雞的親緣關系最遠。其他魚類親緣關系介于兩者之間(圖2)。

2.3 虹鱒spindlin基因在mRNA水平的表達模式

Spindlin基因在二倍體雌性虹鱒的卵巢、腎、肝、脾、肌、鰓、心、眼、腸和鰭等組織中均有表達。且spindlin基因在卵巢組織中的表達與其他各組織差異極顯著(P＜0.01),明顯高于其他各組織的表達。在其他組織如腎、肝、脾、肌肉、鰓、眼、腸和鰭之間相對表達量差異不顯著(P＞0.05),但在心臟和鰭中的表達,與其他組織有顯著性差異(P＜0.05,圖3A)。

通過分析spindlin基因在卵巢組織中不同發育階段不同倍性的相對表達量,可得出以下結論,在240—300 dpf發育階段,與三倍體雌性虹鱒不同發育時期卵巢相比,二倍體雌性虹鱒中spindlin基因的相對表達量顯著的下降,在300—330 dpf階段,表達量有回升,但恢復不到240 dpf的表達量水平。且在240、270和330 dpf階段之間差異不顯著(P＞0.05)。在240—330 dpf發育階段,與二倍體雌性虹鱒不同發育時期卵巢相比,三倍體雌性虹鱒中spindlin基因的相對表達量顯著的上升,240 dpf與270 dpf、300 dpf和330 dpf存在極顯著差異(P＜0.01),270、300和330 dpf之間差異不顯著(P＞0.05)。在同一發育階段中,spindlin基因在二倍體雌性虹鱒卵巢中的表達量較三倍體雌性虹鱒相對較高,且均存在極顯著差異(P＜0.01,圖3B)。

2.4 二倍體與三倍體虹鱒卵巢組織學觀察結果分析

在240—330 dpf階段時,二倍體虹鱒卵母細胞體積逐漸增大,核仁的數量也在增多,在卵母細胞膜的邊緣出現零散的濾泡細胞(Follicle cell,Fc),外排的核仁形成類核周體(Nuage,Nc),胞質與核膜之間出現透明層,隨后,卵母細胞繼續變大,透明層消失。與二倍體虹鱒不同,三倍體虹鱒在240—330 dpf發育階段卵巢發育異常,卵原細胞包囊化,形成卵原細胞簇,通常由4—6個卵原細胞外被一層膜包裹。通過Spin蛋白在卵巢組織中的表達和定位分析,可以得到如下結論,在240—330 dpf發育階段,二倍體雌性虹鱒(圖4A)與三倍體虹鱒(圖4B)的卵巢組織中均有特異性表達條帶,從其深淺變化結果與實時熒光定量結果基本一致。對于二倍體虹鱒卵巢,在240 dpf,陽性信號主要集中在細胞核內,且陽性信號最強(圖5a),在270 dpf時,信號在核內減弱,向胞質擴散(圖5b),在300 dpf時期,核內信號持續降低,到達最低點,胞質信號逐漸增強(圖5c),而330 dpf時,核內信號回復,但仍比240 dpf時弱(圖5d)。這與卵母細胞發育軌跡是相同的。對于三倍體虹鱒卵巢,由于主要存在敗育的卵母細胞和卵原細胞簇,在240—330 dpf階段,在卵原細胞中表達,且信號逐漸加強,在卵原細胞簇間隙的濾泡細胞有較弱的信號。

3 討論

圖2 Spin氨基酸序列NJ系統進化樹Fig.2 The Neighbor-Joining Phylogenetic tree for amino acid sequences of Spin

圖3 spindlin基因實時定量表達情況Fig.3 Real-time quantitative expression of spindlin genes

圖4 Spin蛋白在虹鱒二倍體與三倍體卵巢組織中不同發育時期表達情況Fig.4 Spin protein expression in different developmental stages in the diploid and triploid ovarian tissues of rainbow trout

本研究克隆得到了虹鱒spindlin基因cDNA序列全長,編碼由245個氨基酸組成的蛋白質,預測分析不存在信號肽,且無跨膜螺旋區,由于蛋白質磷酸化和去磷酸化對細胞周期的調控是有重要作用的,在分析該基因可能存在的磷酸位點可知,絲氨酸和蘇氨酸的位點最多,且絲氨酸得分最高,在之前的研究中證明,Spin蛋白質是MAP激酶途徑中的底物,它在絲氨酸或蘇氨酸殘基上的磷酸化是必不可少的,它與主軸相互作用發揮功能,說明可能通過磷酸化spindlin來進行減數分裂細胞周期的調控[18—20]。小鼠的spindlin基因轉錄在未受精和受精后2細胞期到4細胞期可以被檢測到,到8細胞以后未見有表達。在雞中,在早期胚胎中chSpin-W和chSpin-Z都被轉錄,chSpin-Z在成年雞的各種組織中表達,而chSpin-W在卵巢顆粒和睪丸細胞中有顯著表達。在銀鯽中,其轉錄產物可以從成熟卵到囊胚胚胎中檢測到,但其含量從2細胞期降低,在原腸胚階段后的階段中無法被檢測到[21]。在這次研究中,在成魚虹鱒各組織中均有表達,但在卵巢表達量最高,說明spindlin基因在卵母細胞成熟過程持續發揮作用,并不是只在胚胎早期有調控功能。在240—330 dpf發育階段,spindlin基因在二倍體雌性虹鱒卵巢組織表達量無顯著性差異,在三倍體虹鱒卵巢組織呈現低水平表達且為上升趨勢,由于魚類卵母細胞在成熟階段,先停滯在減數第一次分裂的G2期末,即生發泡(Germinal vesicle,GV)期,隨后,在促黃體激素作用下,再次恢復減數分裂,完成卵母細胞成熟[22]。值得注意的是卵母細胞完成從第一次減數分裂雙線期向中期的轉變時,會發生核膜破裂,皮層區細胞骨架的重排和減數分裂紡錘體的組裝等事件。由于三倍體虹鱒存在第三套染色體,在減數分裂偶線期,即同源染色體聯會發生紊亂,使得減數分裂不能正常進行,無法排出成熟配子,導致不具備受精能力。三倍體虹鱒的spindlin基因低表達恰好證實了這一觀點。在三倍體虹鱒發育后期階段,性腺敗育形成的卵原細胞簇,會進行再分化形成類生精細胞囊,此時與卵原細胞簇并存,且類生精細胞囊成為性腺結構的主要組成成分,卵巢呈現類雄性化,由于不能正常產生精子,最終會出現大量敗育的精子細胞[23],在此階段可能是spindlin基因表達上升的原因,但這一推測仍需進一步驗證。

圖5 Spin蛋白在虹鱒二倍體與三倍體卵巢組織中不同發育時期表達分布狀況Fig.5 Distribution of Spin protein in different gonadal stages of diploid and triploid female rainbow trout

關于Spin蛋白在核仁中的定位,在免疫組化結果顯示,Spin蛋白質表達模式符合特定的亞細胞定位,并且與特定功能一致[24]。核仁是在卵母細胞和胚胎發育重要的細胞器,并且在卵子發生過程中發生廣泛的形態學變化[25,26]。密集的核仁定位意味著spindlin可能是組成調控卵母細胞生長過程的重要因子,且可以作為追蹤核仁形態變化和功能作用的標志物。顯示的數量眾多的核仁可能與虹鱒卵母細胞發育有關。

根據前人研究發現,在240—330 dpf發育階段,spindlin基因在二倍體雌性虹鱒與三倍體虹鱒卵巢組織中的表達量呈現的趨勢同細胞自噬調控通路mTOR(Mammalian target of rapamycin)受體基因TOR1變化趨勢一致[27],有研究表明,細胞自噬在三倍體雌性虹鱒性腺敗育過程中起重要作用,由于mTOR通路在三倍體雌性虹鱒卵巢發育的過程中受阻,細胞自噬水平增加,使得細胞內相關基因轉錄翻譯發生紊亂,甚至缺失。關于spindlin基因是否與這一通路有關還未見報道,但在人類研究中,已表征了兩個Spin蛋白同系物(Spin-1和Spin-2),揭示了其與抗凋亡和腫瘤發生有關[28],這為進一步探討spindlin基因功能提供了有力的證據。三倍體虹鱒性腺敗育的發生機制還需進一步探討。