唇?bmp2a基因克隆及其與肌間刺骨化相關性分析

陳 潔 呂耀平 戴慶敏 張 樂 徐傳保 陸 君

(1.麗水學院生態學院,麗水 323000;2.麗水學院醫學與健康學院,麗水 323000;3.麗水市農業農村局,麗水 323000)

多數淡水魚類,尤其是鯉科魚類都具有一定數量的肌間刺[1—3]。肌間刺的存在影響了魚肉的食用和深加工。為了去除肌間刺,人們早在20世紀60年代就開展了肌間刺的研究工作[4]。肌間刺是位于椎骨兩側肌肉中的膜性硬骨,由肌隔結締組織不經軟骨階段直接骨化而成[5,6]。肌間刺的形成開始于間葉細胞,由間葉細胞轉變為成骨細胞[7]。然而,到目前為止,對于肌間刺的研究工作主要集中于形態學方面[3,8],對其形成的分子機制研究的較少。

骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)屬于轉化生長因子β(Transforming growth factorbeta,TGF-β)超家族。目前,已經鑒定了30多個骨形成蛋白[9]。骨形成蛋白是一類具有廣泛生物活性的生長因子,除具有誘導骨形成功能外,還參與了造血組織發育、胚胎發育、神經發育和脂肪生成與代謝等諸多過程[10—12]。在骨形成蛋白家族中,BMP2屬于分泌性多功能蛋白,具有較強的誘導骨細胞形成的能力。例如,BMP2在間葉細胞分化為成骨細胞過程中起到重要的調控作用[13]。目前,bmp2基因已在斑馬魚(Danio rerio)[14,15]、團頭魴(Megalobrama amblycephala)[16]、建鯉(Cyprinus carpiovar.Jian)[17]和金頭鯛(Sparus aurata)[18]等魚類中被克隆報道。在團頭魴中,bmp2基因表達與肌間刺骨化存在一定的關系[16]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.2 唇?bmp2a基因cDNA克隆及序列分析

表1 引物序列Tab.1 Primers used in this study

1.3 茜素紅染色

1.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)

1.5 免疫組化

1.6 數據分析

所有數據均以平均值±標準誤表示。使用IBM公司SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析,P＜0.05表示顯著性差異。

2 結果

2.1 唇?bmp2a基因序列分析

氨基酸多重序列比對顯示魚類BMP2保守性較高且都具有信號肽、TGFβ前肽結構域(TGFβ propeptide domain)和TGFβ結構域(TGFβ domain)。在TGFβ結構域中存在一個N-糖基化位點。此外,包括唇BMP2A蛋白在內,魚類BMP2蛋白都具有7個保守的半胱氨酸殘基。

圖1 基于BMP2蛋白氨基酸序列構建的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on the complete amino acid sequences of the BMP2 protein

2.2 唇?尾部肌間刺四個主要發育階段的形態特征

圖2 唇肌間刺骨化的四個關鍵時期Fig.2 Development characteristics of intermuscular bones in the four key development stages of barbel steed

2.3 唇?bmp2a基因組織差異表達

利用RT-qPCR檢測bmp2a基因在唇成魚不同組織中的表達情況,結果顯示,bmp2a在被檢測的組織中均有表達,在鰓中的表達量最高,肝中次之,在心臟中表達量最低。在鰓中的表達量是在心臟中的28.1倍(圖3)。

2.4 唇?BMP2A蛋白在不同組織中的分布

2.5 肌間刺骨化過程中bmp2a基因的表達

利用免疫組化發現BMP2A蛋白在肌肉肌隔處有表達,為進一步確定bmp2a基因與肌間刺骨化的相關性,在肌間刺骨化的四個關鍵階段,檢測了尾部肌肉組織中bmp2a基因的表達情況。結果顯示,唇bmp2a基因隨著肌間刺的骨化其表達量逐漸升高,與階段Ⅰ比較,bmp2a基因在階段Ⅱ和Ⅲ的表達量顯著升高,此時肌間刺正在快速骨化。到了階段Ⅳ,bmp2a基因表達量有所降低,但與階段Ⅰ比較仍顯著升高,此時肌間刺已進入最終骨化階段(圖5)。

3 討論

BMP2屬于骨形成蛋白家族,是分泌型多功能蛋白,具有較強的誘導骨細胞形成的能力。目前,bmp2基因已在斑馬魚[14]、團頭魴[16]、建鯉[17]和金頭鯛[18]等魚類中被克隆報道。在團頭魴中,bmp2基因表達與肌間刺骨化存在一定的關系[16]。為進一步明確bmp2基因與肌間刺骨化的相關性。本研究克隆得到了唇bmp2a基因cDNA序列。經多重序列比對發現魚類BMP2蛋白都具有一個高度保守的TGFβ結構域,在該結構域中存在一個N-糖基化位點,這一特征表明BMP2蛋白在脊椎動物中具有非常保守的功能,特別是與骨發生和骨形成等細胞分化相關[18]。此外,包括唇BMP2A蛋白在內,魚類BMP2蛋白都具有7個保守的半胱氨酸殘基[17,18]。

圖3 唇bmp2a基因組織差異表達分析Fig.3 The relative expression of bmp2a in different tissues of the barbel steed

圖4 唇BMP2A蛋白在不同組織中的分布Fig.4 Distribution of BMP2A protein in different tissues

圖5 唇bmp2a基因在肌間刺骨化不同階段的表達Fig.5 Relative expression patterns of bmp2a during intermuscular bone development

BMP2 被認為是活性最強的唯一能單獨誘導成骨的因子[28],在骨骼形成的起始和調節中具有主要作用[29]。免疫組化實驗證實唇BMP2A蛋白分布于肌肉肌隔中。為了進一步明確唇bmp2a基因與肌間刺骨化的相關性,利用RT-qPCR檢測了唇bmp2a基因在肌間刺骨化的4個關鍵時期的表達。結果顯示,唇bmp2a基因隨著肌間刺的骨化其表達量逐漸增加,與階段Ⅰ相比,階段Ⅱ到Ⅳ的表達量均顯著增加。階段Ⅱ到Ⅲ,肌間刺處于快速骨化階段,bmp2a基因表達量持續增加,到了階段Ⅳ,bmp2a基因表達量有所降低,此時肌間刺骨化接近于完成。bmp2a基因表達與肌間刺的骨化時序相吻合。此外,發現與階段Ⅰ相比,階段Ⅲ時bmp2a基因表達最高,表達增長3倍多,而在團頭魴中也發現類似的變化,團頭魴bmp家族基因從階段Ⅰ到階段Ⅳ變化倍數都在2倍左右[16]。雖然變化倍數不是特別明顯,但是BMP蛋白屬于轉化生長因子β超家族,可通過其受體觸發級聯反應[30],從而對肌間刺骨化起到一個較強的調控作用。