海水養殖尾水處理系統中微生物群落對水處理階段的響應

胡高宇 張 翔 陳 琛 范建勛 肖國強 蔡景波 柴雪良

(1.浙江省海洋水產養殖研究所,溫州 325005;2.浙江省近岸水域生物資源開發與保護重點實驗室,溫州 325005;3.上海海洋大學水產與生命學院,上海 201306;4.三門縣農業農村局,臺州 317100)

隨著漁業資源的衰退,我國捕撈產業產量已經難以高速增長,為了滿足國內對水產品的需求,水產養殖進入快速增長時期。2017年中國漁業統計年鑒[1]顯示,全社會漁業產值為12002.91億元,其中捕撈業占20.06%,養殖業占74.60%,我國水產品市場需求主要由養殖業提供。養殖帶來的不僅僅是經濟效益,殘餌、排泄物、溶解性氮磷等成為養殖過程中的主要污染物。將未經處理的養殖尾水排放至水環境中,會對水環境造成不良影響,因此,如何以較低成本和較高效率來凈化養殖尾水將成為綠色養殖業發展的關鍵問題之一。

生物膜法是養殖尾水處理中最常用也是最經濟的方法,因其綠色環保、效果較好等特點受到廣泛關注。生物膜法主要是利用濾料表面微生物的生長繁殖來消耗水體中有機物質,以此達到脫氮的目的,目前在水處理工程中以硝化和反硝化作用為核心的技術已經被廣泛應用[2,3]。研究表明,通過添加生物填料可以增大生物膜與水體的接觸面積,以此加強對水體處理效果[4]。國內對生物填料的研究有較多文獻記載,目前研究較多的材料有:陶粒、彈性填料、活性炭、聚乙烯材料、牡蠣殼和藤壺殼等。支瑩等[5]以粉煤灰為原料的輕質陶粒作為生物填料,結果發現對COD、TN和TP去除率分別可達83.57%、74.61%和80.17%;王威等[6]利用聚乙烯材料成功培養生物膜之后,24h內氨氮去除率90%以上;以牡蠣殼為填料對城市生活污水處理時,COD去除達到38%,當水力停留時間4h以上時氨氮去除率97%[7];藤壺殼對對蝦尾水進行處理時發現,隨著填充率的增加處理效果越好[8];李倩等[9]利用彈性毛刷對羅氏沼蝦養殖系統的水質進行凈化,取得了較好的效果。

鹽生植物也是修復海水養殖尾水的重要手段之一[10],目前已經有較多的鹽生植物被應用于養殖尾水的治理當中,有研究發現堿蓬對養殖富營養化水體進行原位修復后,海水中的氮磷含量均有明顯下降[11];以蘆葦構建人工濕地較好地去除了養殖尾水污染物[12];曾碧健等[13]通過種植海馬齒生態浮床不僅增加了池塘中的浮游生物多樣性也降低了有機質含量。吳英杰等[14]利用北美海蓬子生態浮床對養殖海水進行凈化,結果發現生態浮床對水體具有顯著的凈化效果,其中以50%的覆蓋面積對海水中的N、P以及COD去除效果最好。

本實驗通過設計不同類型的功能池對海水養殖尾水進行分級處理,以16S rRNA基因高通量測序技術分析水體和生物膜的微生物群落組成,以期揭示在不同處理階段中微生物菌落結構的動態變化。

1 材料與方法

1.1 實驗裝置

本實驗裝置采用的生物填料有彈性填料(塑料毛刷,單元直徑15 cm,中心串聯一根尼龍繩周圍呈毛刷狀)、陶粒(規格為直徑2—3 cm)以及北美海蓬子生態浮床(植株長度20—30 cm,每平方米9盆,70—80株的正方形浮床),采用這三種不同的材料構成填料組合,對南美白對蝦的養殖尾水進行凈化處理,尾水處理系統由沉淀池、陶粒池以及除磷池組成(圖1)。養殖尾水處理系統總長50 m,寬7 mm,高1.2 m,總面積350 m2,在每個處理池末端設置不同高度的多個平行出水管以形成落差,最高處水位1.2 m,最低處水位0.7 m,6個處理池高度和面積一致,每個池用底部連通的隔水墻分隔成兩部分,促使水流上下流動,避免產生靜水區。系統采用序批式處理,尾水日處理量約5×105kg,水力停留時間為1h,不進行回流。高位池養殖尾水由水泵抽入1號沉淀池,在高度差的作用下逐級流入后續處理池。陶粒池裝填量為35 m3;4個沉淀池全部掛上塑料毛刷,懸掛密度為每平方15根(直徑15 cm,長1.2 m),并在池底做好固定以防止毛刷漂浮;除磷池中生態浮床占30 m2,剩余空間懸掛毛刷,懸掛方式與沉淀池相同。

圖1 海水養殖尾水處理系統Fig.1 Mariculture waste-water treatment system

1.2 樣品采集

水樣采集順序分別是進水口(W1)、1號沉淀池(W2)、2號沉淀池(W3和W4),3號沉淀池(W5和W6)、4號沉淀池(W7)、陶粒池(W8)、除磷池(W9)。垂直采集每個處理池的進出水口水樣,混勻后以0.45 μm孔徑的濾紙進行抽濾后再測定水質。水質檢測指標有:化學需氧量(CODMn)、懸浮物顆粒(TSS)、營養鹽(氨氮NH3-N、亞硝酸鹽N、硝酸鹽以及活性磷酸鹽。水質檢測均按照國標GB17378.4-2007海洋監測規范方法進行。

生物膜樣品采集主要包括塑料毛刷,陶粒以及北美海蓬子根系。塑料毛刷的樣品采集順序為1號沉淀池(MS1和MS2)、2號沉淀池(MS3和MS4)、3號沉淀池(MS5和MS6)、4號沉淀池(MS7和MS8)以及除磷池(MS9),毛刷通過無菌剪剪下3根,長度為5 cm;陶粒樣品采集自陶粒池,按進水先后順序編號C1和C2,每個處理池各隨機采集等重且規格一致的陶粒5顆;北美海蓬子根系樣品采集自除磷池生態浮床,隨機采集20 g根系(編號為Root1)。

1.3 環境基因組提取及高通量測序

將生物填料樣品用無菌生理鹽水沖洗,使用SB-5200DT超聲波清洗機(40 kHz,15min)分離生物填料上的生物膜,用0.22 μm孔徑的濾膜(MF-MillipoteTM,Ireland)對超聲后的懸液進行抽濾,待液體不能被過濾之后保存濾膜,抽濾后留在濾膜上的樣品即生物膜;水樣微生物采集用相同的濾膜對水進行抽濾,每個樣品均保存濾膜2片,抽濾結束后將濾紙保存于-80℃超低溫冰箱,用以后續實驗。

生物膜DNA的提取采用水樣基因組DNA快速提取試劑盒,將濾膜剪碎之后用試劑盒Water DNA kit(Omega)進行提取。在完成基因組DNA抽提后,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。使用ABI GeneAmp?9700型PCR儀進行PCR擴增,PCR擴增16S rRNA的V4+V5區,采用TransStart Fastpfu DNA聚合酶,引物序列為515F:5′-GTGCC AGCMGCCGCGG-3′;907R:5′-CCGTCAATTCMT TRAGTTT-3′。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收。將PCR產物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(Promega公司)檢測定量,之后按照每個樣本的測序量要求,進行相應比例混合,構建Miseq基因文庫。

1.4 Illumina數據分析

高通量測序平臺為Illumina Miseq PE250,Miseq測序得到的PE reads首先根據overlap關系進行拼接,同時對序列質量進行質控和過濾,區分樣本后進行OTU聚類分析以及物種分類學分析。OTU(Operational Taxonomic Units)指的是在遺傳學的研究中,為了便于分析人為的給某一分類單元設置的統一標志,通常可以認為一個OTU代表一種微生物。利用Uparse Version(7.0.1001)對所有樣品的有效序列進行聚類,通常將高于97%相似性的非重復序列進行聚類,在聚類過程中去掉嵌合體得到OTU代表序列。隨后再對OTU表進行篩選,保留了至少3個樣本中序列數都大于等于5的OTU以及序列數總和大于等于20的物種,以此得到有效序列[15]。分析物種結構組成時,為防止葉綠素干擾,去除OTU中的葉綠體以及豐度較低物種之后,再對OTU進行統計分析。

使用QIIME軟件分析α-生物多樣性,R語言分析β-生物多樣性,R語言的“Indicspecies”包分析基于指示值挑選顯著性(P＜0.05)的標志物種,以STAMP軟件對指示種作多組別比較分析,用Canoco軟件作冗余分析(Redundancy Analysis,RDA)篩選與細菌群落變異相關的主要環境因子。

2 結果

2.1 測序質量分析

對測序結果的微生物序列進行分析(表1),21個樣品總共得到的有效序列數是932158條,平均有效序列數是(44388±8392)條,序列的有效覆蓋率全部達到98%以上,在測序條數達到30000條以上時Sobs稀釋性曲線趨于平穩,表明測序數據合理,因此該測序結果能夠較好地反映微生物的組成狀態。測序結果總共發現3781種OTU,水體樣品平均OTU數為(834±208)種,生物膜樣品組(生物膜樣品組是對毛刷、陶粒及根系樣品的總稱)平均OTU數為(1489±432)種,水體樣品中平均OTU數值明顯少于生物膜樣品(P＜0.05)。

表1 各樣品高通量測序數據結果分析Tab.1 Analysis of high-throughput sequencing data of each sample

2.2 α-生物多樣性分析

對篩選出來的細菌OTU序列結果進行分析計算,得出相關α-多樣性指數(圖2),采用群落豐富度指數Chao和Ace、群落多樣性指數Shannon指數、Simpson指數和文庫覆蓋率對養殖尾水系統內浮游生物群落進行評估。結果顯示,Shannon指數平均值為4.77±0.93,毛刷組隨著系統運行先增大后減小,平均值為5.32±0.88,水樣組總體呈現先增大后減小,平均值3.99±0.39,陶粒組均值為5.49±0.25;Simpon指數平均值為0.04±0.04,毛刷組先減小后增大平均值為0.03±0.04,水樣組總體先增大后減小平均值為0.06±0.03,陶粒組平均值為0.01±0.01;Ace指數平均值為1610.10±473.17,毛刷組先增大后減小,平均值為1802.98±493.29,水樣組平均值為1331.93±266.79,陶粒組平均值為1605.63±47.91;Chao指數平均值為1562.38±506.22,毛刷組先增大后減小平均值為1894.69±548.76,水樣組平均值為1214.17±247.48,陶粒組平均值為1668.84±60.84。

2.3 微生物群落結構分析

為了解樣品中細菌共有情況,繪制了Venn圖(圖3,未去除葉綠體序列)。結果顯示,樣品中總OTU出現于所有樣品的核心共有菌為546種,生物膜之間共有細菌有699種,僅出現于生物膜的核心共有菌為153種。生物膜組與水樣組中共有菌群最多的是毛刷組,最少的是根系組。毛刷組(2898種)和水體組(2415種)中細菌OTU總數較多,數量幾乎是陶粒(1768種)和北美海蓬子根系(1253種)的兩倍,但樣品OTU均值卻未明顯高于陶粒和海蓬子根系,而且生物膜與水樣之間共有菌數量從大到小依次是毛刷組、陶粒組以及根系組。

圖2 α-多樣性指數分析圖Fig.2 α-diversity index analysis chart

圖3 樣品中微生物組成分布Venn圖Fig.3 Venn diagram of the distribution of microbial composition in samples

經過物種注釋(去除了葉綠體序列),在門分類水平上,以物種在樣品中的相對豐度構建柱形圖(圖4),樣品中主要細菌類群為:變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)及浮霉菌門(Planctomycetes),平均相對豐度分別為(46.08±7.87)%、(24.43±8.87)%、(8.23±5.91)%和(7.09±5.68)%,生物膜和水樣之間差距大導致標準差偏大。變形菌門中以α-變形菌和γ-變形菌兩種細菌含量最高,在變形菌門中平均所占的比例分別為(58.93±19.63)%和(27.37±12.77)%。

在生物膜樣品中的菌群分布較水樣中更加復雜,菌群分布具有明顯差異。浮霉菌門、綠彎菌門(Chloroflexi)、厚壁菌門(Firmicutes)、Verrucomicrobia門、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、Ignavibacteriae門及酸桿菌門(Acidobacteria)在生物膜中含量較高,而水樣中放線菌門(Actinobacteria)相較于生物膜豐度更高。

圖4 微生物門水平(Phylum)上的物種相對豐度柱形圖Fig.4 Community barplot analysis on the phylum level

硝化作用在水處理過程中具有非常重要的作用,在本實驗系統中主要的硝化菌是亞硝化單胞菌屬和硝化螺旋菌(Nitrospirae),它們被認為是去除含氮污染物的重要菌群,在系統中主要分布在生物膜中,主要在黏土陶粒C1(1.01%,1.78%)和C2(0.28%,0.71%)及北美海蓬子根系(0.05%,1.67%)中含量較高,塑料毛刷和水樣中含量極低。

其他一些常見菌種在尾水系統中分布也有較大差異,如綠彎菌門,在生物膜和水樣中占比分別為4.44%和0.15%,該菌種主要分布在生物膜上,可能是生物膜骨架的基本組成成分;作為有機高分子的分解者黃桿菌綱(Flavobacteriia),在尾水系統中每個處理池中均有發現,平均占比10.05%;芽孢桿菌(Bacillus)是水產養殖常用的益生菌,在各處理池中檢測到的豐度均較低(陶粒組平均2.96%,毛刷組0.19%,水樣組0.28%,根系0.31%),而且在陶粒樣品C2中含量最高(C1中0.07%,C2中5.84%)。

2.4 β-生物多樣性分析

NMDS分析為了解不同樣本之間的差異性,對水體和生物膜進行聚類分析,基于Bray-Curtis和Unweighted-Unifrac 兩種距離算法對尾水系統中的樣品進行分析(圖5和圖6),在兩個圖中樣品均被分成兩個部分,表明了水體和生物膜上菌群群落組成具有明顯差別。在水樣中,樣品W1(進水口)和W7(4號沉淀池)具有明顯的差異性,與其他樣品點的相對距離較遠;在生物膜樣品中,MS1、MS2、MS8和MS9與其他樣品均距離較遠,這可能是尾水系統中不同處理階段導致,陶粒以及北美海蓬子根系因為載體材料的不同,與塑料毛刷樣品點也相距較遠?；趦煞N算法下的壓力系數(Stress)均小于0.2,表明結果具有較好的擬合度,能夠準確地反映系統內菌群的組成情況。

RDA排序分析根據表2分析結果顯示,尾水系統中對菌群分布產生最大的影響因子為磷酸鹽,磷酸鹽對整個菌群的影響具有顯著性相關關系(P＜0.05),其他環境因子對菌群結構無顯著性影響(P＞0.05)(水質檢測結果見表3)。根據圖7中樣品點在圖中占據的位置,可以分成4個部分:在尾水系統中分布靠前的MS1和MS2;處于系統中部的MS3,MS4和MS5;處于靠后位置的MS6、MS7、MS8、C1、C2及單獨的MS9。這反應了在系統前期處理階段中,以化學需氧量作為主要的影響因子,到了處理階段后期影響較大是磷酸鹽和氨氮。

不同功能組的指示物種分析指示種可以用來反映自然環境的變化狀況,可以通過指示值(IndVal)方法進行計算,該方法最早于1997年由Dufrêne 和Legendre提出[16],由于這種方法可以將某種環境狀態內具有高專一性和高忠實性的物種篩選出來,對環境變化具有較好指示效果,因而被廣泛用于生物指示的研究中[17,18]。

圖5 基于Bray-Curtis距離NMDS分析Fig.5 NMDS analysis(based on the Bray-Curtis distance)

圖6 基于Unweighted-Unifrac距離NMDS分析Fig.6 NMDS analysis(based on the Unweighted-Unifrac distance)

表2 RDA排序分析環境因子表Tab.2 The environmental factors in RDA analysis

表3 水質檢測結果Tab.3 The result of water quality

通過物種指示值進行計算,對采集的樣品在P＜0.05顯著性水平上進行指示種挑選,在屬水平上共選出160種細菌OTU,這160個物種主要屬于變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門及放線菌門,為了解這些物種在系統中分布情況,將其進行聚類分析(圖8)。根據聚類結果可以明顯看出指示種被分成不同部分,不同材質樣品被分成3組:黏土陶粒組、塑料毛刷和北美海蓬子根系組以及水樣組;同種材質的樣品(主要是毛刷組和水樣組)按照其在系統中的處理階段被分開聚類(按處理前中后三階段將較為相似的樣品聚類到一起)。

采用STAMP軟件在P＜0.05顯著性水平對挑選出來的160種細菌在綱(Genus)水平上作熱圖分析(圖9),可以看出樣品的主要差異物種屬于藍細菌、α-變形菌(Alphaproteobacteria)及γ-變形菌(Gammaproteobacteria);浮霉菌、黃桿菌及δ-變形菌(Deltaproteobacteria)相對差異較小。

3 討論

3.1 水處理階段和載體對微生物群落的影響

隨著分子生物學的發展,高通量測序方法已經逐漸成為研究微生物群落的主要手段,通過對16S rRNA基因測序分析可以獲得大量有效序列,包括那些非可培養細菌數據,這就使得可以更加深入地探索微生物群落結構多樣性。對高通量測序而言,測序的數量和深度是影響測序結果的主要因素。在本研究中,對序列采取隨機抽樣以及它們所表示的OTU數構建Sobs稀釋曲線,在稀釋曲線中隨著抽取序列數的增加而曲線逐漸趨向平坦,這表示本次測序數據可以反映樣本的真實情況。

本實驗尾水系統采用序批式處理,尾水通過不同類型的功能池分級處理,不同類型功能池中微生物群落分布具有較大差異。從Shannon指數圖變化可以看出,在尾水剛進入處理系統時,由于水體之間混合作用以及尾水富營養的特點改變了生活環境,導致細菌不適應而豐度減少,隨著處理池中營養被分解利用,細菌生長恢復并緩慢上升,這與毛刷中菌群變化不同,毛刷生物膜菌群在尾水高營養條件下迅速繁殖,但是在生物膜成熟的同時也伴隨著菌膜脫落,脫落的細菌一部分死亡,另一部分則在水體中存活而導致水中豐度增加,因此這可以解釋為什么在水中的營養被消耗殆盡之后,同一個處理池中水樣W7 的Shannon指數出現上升而毛刷MS8的Shannon指數出現下降的情況。陶粒內外表面孔隙率較高且粗糙,對水體中有機物和細菌具有較強吸附效果[19],Shannon指數上陶粒高于水樣的原因可能是陶粒為細菌的生長提供了充分的載體。北美海蓬子根系的菌落豐度也大于水體,其原因可能是因為植物根系作為一個有機體,形成了其特有的根際微生物群落,從而導致了菌群差異。

圖7 生物膜樣品與水環境的RDA排序圖Fig.7 RDA ordination biplot between biofilm samples and environmental factors in the system

圖8 指示物種Cluster聚類分析圖Fig.8 Indicator species cluster analysis

為了解不同載體材料對菌群的影響,通過基于Bray-Curtis以及Unweighted-Unifrac距離來分析遺傳進化和群落結構關系,對比生物膜在該算法下的距離位置,發現與分析結果是相似的。在本研究結果中不同處理階段及不同材質的生物膜樣品在NMDS圖中均相距較遠,在樹狀聚類圖中也分別進行聚類。水樣組也有同樣的結果,根據處理階段具有不同的表現。同時利用距離矩陣對毛刷和水樣的菌落結構分析,發現其組內變化無顯著差異(P＞0.05),這意味著整個水處理過程中,環境變化對毛刷生物膜和水體中菌群動態變化的影響程度是類似的,而造成群落之間差異的主要原因是載體材料不同。生物填料為生物膜的培養提供了附著條件,不同類型的載體材料由于內部結構及其物理性質不一樣,選擇性地篩選水體中的細菌作為附著細菌,生物填料通過富集作用導致營養物質含量不同,從而造成了菌落在生物膜與水體之間的差異性。生物填料差異性在不同組分之間的共有菌群占比上也有體現,毛刷(49.21%)、陶粒(32.53%)與水體的共有菌占比較高,說明該類型生物膜是通過富集水體菌群提供了強化的水凈化能力;然而,根系與水共有菌占比低(19.25%),這可能是根際微生物引起的菌群結構差異,同時也暗示了根際生物膜可能具有不同于無機物填料生物膜的水處理能力。

3.2 不同水處理階段生物膜中的氮循環相關菌群

水產養殖尾水中含有大量的氮元素,氮的轉化涉及了微生物的固氮、硝化與反硝化作用等,地球氮循環主要就是由微生物介導,其中起著重要作用的一類菌群就是變形菌門[20—22]。α-變形菌綱包含許多固氮細菌;β-變形菌綱(Betaproteobacteria)中的亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)是常見的氨氧化菌;反硝化作用是生物脫氮的關鍵步驟,關系到廢水處理系統的除氮效率,負責反硝化作用的細菌主要分布于α-變形菌綱和β-變形菌綱[23];γ-變形菌和δ-變形菌綱主要是兼性異養細菌,可以通過有氧和無氧呼吸對有機物進行分解代謝[24]。硝化細菌在水體氨氮、亞硝酸鹽和硝酸鹽之間相互轉化中發揮著不可替代的作用,硝化細菌由氨氧化細菌和亞硝酸鹽氧化細菌兩類菌群組成,其中的亞硝化單胞菌屬、亞硝化葉菌屬(Nitrosolobus)、亞硝化弧菌屬(Nitrosovibrio)、亞硝化球菌屬(Nitrosocuccus)和亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)是常見的氨氧化菌,亞硝酸鹽氧化菌中的硝酸桿菌屬(Nitrobacter)、硝化球菌屬(Nitrococcus)、硝化螺菌屬(Nitrospira)和硝化刺菌屬(Nitrospina)在氧化亞硝酸鹽上發揮著重要作用[25]。

圖9 指示種按綱水平(Class)在不同樣品中的分布熱圖Fig.9 The heatmap of indicator species in different samples on class level

在本研究中海水養殖尾水處理系統的氨氧化菌主要是亞硝化單胞菌屬,亞硝酸鹽氧化菌是硝化螺菌屬,在尾水系統中主要分布在黏土陶粒以及北美海蓬子根系中,在陶粒和根系樣品中占比分別是2.79%(C1)、1.00%(C2)以及1.72%(Root);塑料毛刷中有少量的亞硝化單胞菌屬分布,水樣中硝化細菌檢出極低,因此在尾水處理系統中陶粒和北美海蓬子根系可能是進行硝化作用的主要場所。從黏土陶粒上硝化菌的比例來看,一級陶粒池生物膜上硝化細菌含量最多,二級陶粒池和除磷池中的硝化細菌含量較為接近,因此一級陶粒池硝化作用可能強于二級陶粒池以及北美海蓬子生態浮床。

除了變形菌的反硝化作用,有研究發現生物膜中還存在著其他菌群可以穩定硝酸鹽濃度[26,27]。黃桿菌存在于生物膜內層,在缺氧條件下可以利用硝酸鹽或者亞硝酸鹽進行無氧呼吸,在去除氮同時也可以氧化有機質,這種被稱為異化性硝酸還原作用[28],黃桿菌在所有樣品中平均占比10.05%,在一定條件下它們也將發揮著凈化水體氮元素的職能。屬于厚壁菌門的芽孢桿菌是一種益生菌,它們也可以通過自身代謝顯著降低水體中的亞硝酸鹽濃度[29],孟睿等[30]用芽孢桿菌為實驗菌種對水產養殖廢水進行控制處理,發現廢水中的COD和亞硝酸鹽濃度明顯降低;王亞南等[31]發現芽孢桿菌在近海養蝦場底泥中具有超過50%的生物量,其中有一部分細菌具有還原硝酸鹽降低氮素含量的作用。芽孢桿菌在尾水系統中均有分布但是含量較低,在陶粒池中含量最高(陶粒組平均2.96%,毛刷組0.19%,水樣組0.28%,根系0.31%)。有研究指出[32],與水質凈化具有相關聯的菌群中仍存在著大量不能培養或未分類鑒定的物種,這些功能性菌群的生長在維持水體氮平衡中起著至關重要的作用。

3.3 水處理系統指示物種

由于不同階段水處理過程中群落結構存在顯著性差異,我們篩選出160種指示物種,研究結果發現篩選出來的指示物種能夠明顯地區分出樣品的來源與功能(圖8和圖9),因此,指示物種的豐度變化可以用來作為區分樣品來源和載體材質的指標,同時也可以用來反映尾水系統中生物膜的成熟度和穩定性。熱圖分析顯示指示種中差異最大的是藍細菌,聚球藻(Synechococcus)是其中差異最大的物種,大部分聚球藻可以利用硝酸鹽和氨作為他們生長所需的氮源,處理前期高濃度營養提供了合適的生長環境,是提供初級生產力的重要貢獻者。除了藍細菌,其次是α-變形菌綱和γ-變形菌綱,這兩類變形菌中的主要差異菌有紅桿菌科(Rhodobacteraceae)、交替假單胞菌科(Idiomarinaceae)以及著色菌科(Chromatiaceae)。除此之外,篩選出來的物種還有一部分未能分類鑒定,這些菌種缺乏相關資料文獻作為參考,其功能都有待進一步去驗證,這些敏感物種可能是作為評價不同階段下水處理效果的一個生物學指標,是改進尾水處理系統的參考依據之一。

4 結論

在海水養殖尾水系統中,微生物群落主要為變形菌門、擬桿菌門、藍細菌門、放線菌門、浮霉菌門和酸桿菌門。在不同水處理階段中,微生物多樣性指數總體呈現先增長后下降的趨勢,表明養殖尾水中營養元素被充分利用,有機污染物也得到了有效降解。同一階段中生物膜載體材料不同是影響菌群結構的主要因素。北美海蓬子根系和黏土陶粒生物膜中硝化細菌豐度占比遠高于其他功能單元,是硝化作用的主要發生場所。系統前半段,化學需氧量是微生物組成主要影響因子,處理后半段影響較大是磷酸鹽和氨氮。通過物種指示值篩選出160種指示OTU,主要屬于變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門以及放線菌門,這些指示生物可能是作為評價海水養殖尾水處理系統的指標,為水處理系統改進提供參考依據。