沅江常德段蜆屬貝類的譜系、倍性與性別特征

占江凡 裴宏謙 李科靜 皮 杰 曾 聰 李德亮

(1.湖南農業大學動物科學技術學院,長沙 410128;2.湖南應用技術學院農林科技學院,常德 415000)

蜆屬(Corbicula)貝類(簡稱蜆)原產于亞洲、非洲、澳洲和中東地區,自 1924 年首次在不列顛哥倫比亞省溫哥華島被發現后[1,2],逐步開始在北美、南美和歐洲大陸迅速擴散[3—6]。目前蜆已經成為廣布世界各地咸淡水水域的底棲動物優勢類群,且對入侵地的生態和經濟均造成嚴重危害[7]。但由于形態的多樣性和高度可塑性,導致蜆屬的分類仍未得到準確厘定[5,8—10],蜆屬基于形態的分類體系中被證實存在大量同物異名種[11,12],亟需更為準確和有效的分類鑒定方法。隨著分子生物學技術的飛速發展,以傳統形態分類方法為基礎,采用基于DNA 條形碼的系統分類方法,結合倍性、生殖方式等基礎生物學特征的綜合方法被認為是準確厘定蜆屬分類的最有效方法[13,14]。

入侵地蜆的形態和遺傳多樣性均顯著地低于原產地[4,15]。歐洲和美洲均分布有三種形態的蜆,分別為形態 R、Rlc、S 及形態 A、B、C。形態 R 與A、S 與 C 蜆分別共有相同的線粒體COⅠ基因單倍型,形態 Rlc 和 B 蜆COⅠ基因單倍型僅相差 1個堿基[15]。因在基于COⅠ基因單倍型構建的系統進化樹中,形態 R 與 A、Rlc 與 B 及 S 與 C 蜆聚成相互獨立的三支而分別被稱為譜系 RA、RlcB、SC[15]。分別采用線粒體COⅠ基因標記和 Cytb基因標記對洞庭湖區蜆屬進行系統分類,均證實譜系RA 和 RlcB 共存于洞庭湖區,且不同譜系蜆殼長、殼寬和和高之間沒有顯著差異[16,17]。洞庭湖[17]和洪澤湖[18,19]流域河蜆的遺傳多樣性要顯著地高于歐美等入侵地國家。這種遺傳多樣性的差異推測主要是由生殖方式的差異所造成[14,17,20]。

蜆存在雌雄同體和雌雄異體兩種性別系統,其中入侵地蜆均為雌雄同體,通過自體或異體受精營無性生殖(專性雄核生殖),而原產地蜆則雌雄同體和雌雄異體共存,且兩性生殖與無性生殖共存[5,21]。我國蜆屬貝類性別特征存在較大的地域差異性。黃河三角洲徒駭河[22]的河蜆為雌雄異體。遼寧大洋河河蜆在性別分化尚未完全時有少量雌雄同體,性成熟后完全是雌雄異體且性比為1﹕1[23]。淀山湖[24]、珠江[25]和修河[26]以雌雄異體為主,并存雌雄同體個體。但洞庭湖[17]、大通湖[27]、湘江支流撈刀河[20]、贛江[26]及太湖流域的麻漾[28]卻均以雌雄同體為主,并存一定比例的雄性和雌性個體。此外,閩江河蜆為雌雄同體和雄性個體共存[29]。蜆屬貝類的倍性具有多態性,存在有二倍體、三倍體和四倍體三種倍性[30—32]。黃勤通過分析比較發現,雖然均棲息于淡水生境,但福州閩江河蜆為二倍體且雌雄異體,日本的(C. leana)則為三倍體且雌雄同體,而棲息于海水生境的日本蜆C. japonica為二倍體,雌雄異體[33]。此外,蜆屬貝類的譜系、倍性和性別特征之間的關系尚未有全面的分析和報道,而這些問題的梳理對于全面厘定蜆屬的系統分類,掌握其生殖特征具有重要意義。

本研究以沅江常德段蜆為研究對象,采用線粒體COⅠ基因標記對其進行譜系構建,分析其形態、倍性、性別和遺傳多樣性特征,重點梳理譜系與上述特征之間的關系,以期為蜆屬的系統分類和生殖特征研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 形態測量

蜆采集于洞庭湖支流-沅江常德鼎城區段(111.693°E,28.987°N)。樣品殼長(SL)、殼寬(SW)和殼高(SH)采用數顯游標卡尺測量。分離外殼與軟組織后,用電子天平稱量外殼濕重(W),剪取少量外套膜、性腺和閉殼肌用于后續分析。

1.2 COⅠ基因擴增

采用組織基因組 DNA 提取試劑盒提取新鮮樣品外套膜 DNA,測定其光密度,確定其濃度后,保存于-20℃ 條件備用。COⅠ基因序列擴增采用通用引物 LCO 1490和HCO 2198[34]。PCR 反應體系為 20 μL,包括:DNA模板1 μL(100 ng/μL),上下游引物各 1 μL(10 μmoL/L),PCR Mix 10 μL,ddH2O 7 μL。反應條件程序為94℃預變性5min;94℃ 變性 1min,52℃退火45s,72℃延伸1min,共35個循環;最后72℃延伸5min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳確定為目的產物,純化回收送公司測序。

1.3 性別與倍性鑒定

Bouin’s 固定液保存的性腺標本,經酒精脫水、二甲苯透明及透蠟,于石蠟包埋和切片,HE 染色后封片,鏡檢,以確定其性別[20]。新鮮閉殼肌放入 DAPI 染料,震蕩后靜置幾分鐘,過濾,濾液用流氏細胞儀(Sysmex)測相對 DNA 含量,以判斷其倍性。

1.4 數據處理與分析

參考GenBank中其他蜆屬貝類COⅠ基因序列,使用 Geneious R11軟件[35]對測序所得序列進行編輯、排序、校對。采用MEGA6.0軟件[36]中的Clustal W軟件包對校正后的序列(526 bp)進行多重比對,以Corbiculasp.H7COⅠ基因序列(Gen-Bank 登錄號:KT373825)作為譜系構建的外類群,采用Geneious R11構建基于最大似然法(ML)和貝葉斯法(BI)單倍型進化樹(迭代數 200 萬)。采用DNASP 5.0軟件[37]分析序列的單倍型數(H),并計算種群的單倍型變異位點數(S)、單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(π)和平均核苷酸差異數(k)。運用SPSS中的交叉表及Pearson卡方檢驗,分別分析性腺、譜系及倍性之間的相關性。形態參數之間的比較采用以殼重為協變量的協方差分析方法,殼長、殼寬和殼高校正后的數據,以平均值±標準差表示。

2 結果

2.1 譜系聚類

經分析,99 條COⅠ基因序列中存在12 個單倍型,共有 17 個變異位點(表1),單倍型多樣性、核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數分別為 0.599、0.01236 和 6.503。基于最大似然法和貝葉斯法構建的單倍型系統進化樹中,單倍型 1、4、5、6、7、10、12 聚為獨立的一支,單倍型 2、3、8、9、11 聚類為另一支,分別為對應已報道的譜系 RlcB和譜系 RA。外源單倍型 KT373825 聚為獨立的一支,對應譜系 SC(圖1)。

2.2 倍性與性別特征

99 個樣品中有二倍體 50 個、三倍體 49 個,雌雄同體 71 個、雌性 21 個、雄性 7 個。譜系 RA中雌雄同體、雌性和雄性蜆分別為 51、15、1,而譜系RlcB 中分別為 20、6、6;三倍體雌雄同體、雌性和雄性個體分別為 33、17、1,而二倍體分別為38、5、6(圖2)。卡方檢驗發現,譜系與性別(P=0.004)及倍性與性別(P=0.005)之間均存在顯著的相關性。

2.3 群體形態特征

所分析蜆的殼重、殼長、殼寬和殼高分別為1.63—5.45 g、20.07—32.96 mm、18.61—30.56 mm、13.28—19.16 mm(表2)。協方差分析顯示,三倍體蜆的殼長和殼高均顯著大于二倍體,不同性別蜆的殼寬和殼高之間存在顯著差異(P＜0.05)。此外,不同譜系、倍性和性別蜆的殼長、殼寬和殼高之間差異不顯著(P＞0.05)。

表1 12 種 COⅠ單倍型和外類群參考序列(KT373825)的核苷酸變異位點Tab.1 Variable nucleotide sites of 12 mitochondrial COⅠ haplotypes and outgroup reference sequence(GeneBank:KT373825)

圖1 基于最大似然法(左)和貝葉斯法(右)構建的COⅠ基因單倍型系統進化樹(支持率在各節點附近顯示)Fig.1 Phylogenetic trees for the mt COⅠhaplotypes based on the Maximum Likelihood(left)and Bayesian Inference(right,support values are showed next to the nodes)

2.4 群體遺傳多樣性

譜系RlcB的單倍型數、變異位點數、單倍型多樣性、核苷酸多樣和平均核苷酸變異數均高于譜系RA。三倍體的單倍型和變異位點低于二倍體,但其單倍型多樣性、核苷酸多樣性及平均核苷酸變異均高于二倍體。雌性蜆的核苷酸變異位點、核苷酸多樣性及平均核苷酸差異數均高于雌雄同體和雄性個體,但雌雄同體單倍型最多,雄性的單倍型多樣性最高(表3)。

3 討論

3.1 蜆的譜系與形態

作為原產地,亞洲的蜆根據以COⅠ標記所構建的系統進化樹,可以分為淡水和海水兩個類群,且在淡水類群中譜系 SubcladeA和B的蜆具有更廣泛的分布水域[11]。在入侵地北美、南美和歐洲,基于COⅠ標記的系統進化樹將蜆聚類為三個分支,分別對應譜系RA、RlcB和SC[14,38]。原產地蜆的譜系SubcladeA和B分別對應入侵地譜系RA和RlcB。本研究進一步證實了譜系RA和RlcB分布區域的廣泛性[11],同時也再次證實采用COⅠ標記[16]和采用 Cytb標記[17]在洞庭湖蜆中的研究結果,即譜系RA和RlcB共存于洞庭湖區。入侵地不同蜆的形態特征特異,譜系 RA、RlcB和SC蜆在美洲的形態分別為A、B、C,而在歐洲分別對應形態R、Rlc、S[5,39]。洞庭湖區兩種不同譜系蜆的殼長、殼高和殼寬之間沒有顯著差異,進一步證實之前的結果[16,17]。形態的高度多樣性和可塑性對采用傳統形態特征對蜆屬進行分類帶來極大的困難,也使得以傳統形態分類為基礎,采用基于 DNA 條形碼的系統分類方法,結合倍性、生殖方式等基礎生物學特征的綜合方法被認為是準確厘定蜆屬分類的最有效方法[13,14]。此外,本研究還發現三倍體蜆的殼長和殼高均顯著高于二倍體。三倍體較二倍體具有顯著生長優勢的現象在魚類等高等脊椎動物中非常常見[40],但這種因生殖不育給三倍體帶來生長優勢的機制似乎在蜆中并不適用,因為三倍體蜆無論是雌性、雄性還是雌雄同體均可參與生殖。因此,其確切機制還有待與進一步研究。

圖2 不同譜系和倍性蜆的性別組成Fig.2 Sex composition of different lineages and ploidies of Corbicula clams

3.2 蜆的譜系與性別

雖然蜆已經成為廣布世界各地咸淡水水域的底棲動物優勢類群,但其性別的分布具有較大地域差異。入侵地蜆均為雌雄同體且營無性的雄核生殖,原產地蜆則存在雌雄異體和雌雄同體兩種性別體系,且兩性生殖和無性生殖共存[5,21]。Corbicula sandai和C. japonica均是雌雄異體且營兩性生殖,前者僅分布日本的琵琶(Biwa)湖,后者分布于東亞的咸淡水水域,另有少量的兩性蜆分布于印度尼西亞[41,42]。我國黃河三角洲徒駭河[22]的河蜆為雌雄異體。遼寧大洋河河蜆在性別分化尚未完全時有少量雌雄同體,性成熟后完全是雌雄異體且性別為 1﹕1[23]。淀山湖、珠江、修河以雌雄異體為主,并存雌雄同體個體[24—26]。繁殖季節洪澤湖河蜆均為雌雄異體[43],但也發現及少量雌雄同體[44]。但長江中游流域洞庭湖[17]、大通湖[27]、湘江支流撈刀河[20]、贛江[26],長江下游太湖流域的麻漾[28]卻均以雌雄同體個體為主,并存一定比例的兩性個體。此外,閩江河蜆則為雌雄同體和雄性個體共存[29]。Miyazaki[45]認為蜆屬貝類的性別特征與其棲息生境密切相關,并將蜆屬貝類分為三類:淡水生雌雄異體、淡水生雌雄同體和海水生雌雄異體。本研究結果顯示,洞庭湖區蜆屬于淡水生雌雄同體和雌雄異體共存類型,且譜系與性別之間存在顯著的相關性,但該相關性主要體現在性別比例方面,也不足以作為區分譜系的主要生物學特征。此外,蜆屬貝類的倍性與性別或生殖方式之間的相關性也有報道,即所有的二倍體均為雌雄異體,營有性生殖,而營無性生殖的蜆則二倍體、三倍體和四倍體均存在[5,15]。洞庭湖區蜆的倍性與性別之間具有顯著的相關性,但不同倍性的生殖方式還有待于進一步地研究。

表2 蜆的殼重及矯正后的形態參數Tab.2 The shell weight and adjusted morphological parameters of Corbicula clams

3.3 蜆的譜系與倍性

美洲和歐洲等入侵地三個譜系(RA、RlcB和SC)的蜆均為三倍體,而原產地蜆的倍性具有多樣性。日本的C. sandai和C. japonica均為二倍體且營兩性生殖,C. flumilea既有二倍體,也有三倍體,C.leana的雄性個體為二倍體,雌雄同體為三倍體[46]。我國福建閩江的河蜆為二倍體,但四川省安岳縣溪流中的河蜆三倍體和四倍體共存,這也是目前國際上唯一的四倍體蜆的報道[31]。沅水99個樣品中發現二倍體50個、三倍體49個,表明二倍體和三倍體蜆共存于洞庭湖區,但譜系與倍性之間沒有顯著的相關性。因此,倍性也不適合作為區分洞庭湖區不同譜系蜆的生物學特征。黃勤[33]通過分析和比較日本C. japonica(2n=38)、C. leana(3n=54)和福建閩江河蜆C. fluminea(2n=36)的核型,推測三種蜆之間存在演進關系,即:從海水生演化到淡水生,由雌雄異體發展到雌雄同體;相應地,單倍體數由n=19演化為n=18,染色體倍數由二倍體發展為三倍體。該假說為從生殖和倍性兩個方面著手研究蜆屬貝類的演化提供了思路。

表3 蜆線粒體COⅠ單倍型的遺傳多樣性Tab.3 The genetic diversity of mitochondrial COⅠgene of Corbicula clams

3.4 蜆的譜系與遺傳多樣性

入侵地蜆的遺傳多樣性極低,譜系RA和SC個體分別共有其譜系所特有的唯一的線粒體COⅠ基因單倍型,譜系RlcB雖然有兩個COⅠ基因單倍型,但兩個單倍型僅相差1個堿基[5,14,15]。中國、越南、日本172條COⅠ序列中共發現44個單倍型,單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別在 0.284—1.000、0.00001—0.00346[15,47]。沅水99條COⅠ基因序列共發現 12個單倍型,17 個變異位點,單倍型多樣性、核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數分別為0.599、0.01236 和6.503,與前期研究結果相似[17]。譜系RlcB的單倍型數、變異位點數、單倍型多樣性、核苷酸多樣和平均核苷酸變異數均高于譜系 RA,這種差異可能與兩個譜系不同的生殖方式有關,同時也說明譜系與COⅠ單倍型遺傳多樣性之間相關性不強。