長鏈非編碼lncRNA DBH-AS1對瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡的影響及作用機制

賈春英 張榮明

錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院燒傷整形外科（遼寧錦州121000）

瘢痕疙瘩，又稱病理性瘢痕，是由于個體皮膚損傷后的膠原異常積聚所致，主要與成纖維細胞的過度增殖和細胞外基質(zhì)的大量沉積有關(guān)，瘢痕疙瘩臨床表現(xiàn)為皮膚表面的結(jié)痂與斑塊，顏色呈鮮紅或淡紫，自覺瘙癢與刺痛等［1-3］。研究表明瘢痕疙瘩的形成與多種復(fù)雜因素相關(guān)，如細胞因子、炎癥因子和基因調(diào)控等［4-5］。近年來，瘢痕疙瘩的形成機制與調(diào)控機理已成為目前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點，瘢痕疙瘩的治療難題亟需突破［6］。

lncRNA 全稱長鏈非編碼RNA，是一種長度超過200nt 的非編碼RNA。相比編碼RNA，lncRNA具有更強的細胞特異性和組織特異性，并且lncRNA 在不同組織細胞中的表達水平存在差異，同時對細胞增殖、分化、遷移、凋亡和代謝等過程產(chǎn)生顯著影響［7］。研究表明lncRNAs 在瘢痕疙瘩組織和細胞中異常表達，并對瘢痕疙瘩中機理形成起著重要作用［8-9］。lncRNA CACNA1G-AS1 在瘢痕疙瘩中通過調(diào)控鈣通道蛋白CACNA1G 參與瘢痕疙瘩成纖維細胞遷移過程［10］。lncRNA ATB 通過調(diào)控EMT 參與瘢痕疙瘩的形成與發(fā)展［11］。

DBH-AS1是一種長度約為2 kb，從9q34染色體轉(zhuǎn)錄的非編碼RNA［12］。研究表明lncRNA DBH-AS1在骨肉瘤、肝癌等疾病中均發(fā)揮重要作用［13-14］。據(jù)報道DBH-AS1 在肝癌組織和細胞中高表達，過表達DBH-AS1 通過激活肝癌中的MAPK 信號通路促進細胞增殖和存活［15］。然而DBH-AS1 在瘢痕疙瘩中的作用及機制尚未完全闡明。因此本研究采用qRT-PCR 檢測瘢痕疙瘩和正常皮膚組織中DBHAS1 的表達水平，并深入探討DBH-AS1 調(diào)控miR-138/HIF-1α通路在瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡的作用，以驗證lncRNA-DBH-AS1/miR-138/HIF-1α軸對瘢痕疙瘩形成的影響。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本選擇2018 年3 月至2019 年10 月在我院接受瘢痕疙瘩治療患者作為研究對象，共50 例，其中男31 例，女19 例，平均年齡（31.2 ±10.6）歲，所有患者在術(shù)前均未接受手術(shù)、化療、放療或生物治療等，并且排除其他腫瘤及重大疾病的可能。在術(shù)中瘢痕疙瘩和少量周圍正常皮膚組織。所有組織標(biāo)本分成相同大小在30 min 內(nèi)液氮速凍，并在入-80 ℃冰箱內(nèi)保存。所有患者均在簽署知情書的條件下自愿參與本研究。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染瘢痕疙瘩成纖維細胞和正常成纖維細胞采購于中國科學(xué)院北京細胞庫，在37 ℃、5%CO2平衡濕度培養(yǎng)箱環(huán)境中采用含10%胎牛血清的DMEM 細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。選取對數(shù)生長期細胞進行實驗，參考lipofectamine 2000 試劑說明書轉(zhuǎn)染新增si-NL、LV-NC、si-DBH-AS1、LV-DBHAS1、miR-138 mimics、miR-138 inhibitors、si-HIF-1α和LV-HIF-1α，轉(zhuǎn)染24 h后進行下一步實驗。

1.2.2 qRT-PCR按照Trizol試劑盒步驟提取瘢痕疙瘩組織和細胞中總RNA。使用分光光度儀計量RNA 水平。以β-actin 為內(nèi)參通過260 nm 和280 nm吸光度，qRT-PCR 按照SYBR Green 試劑盒說明書進行反應(yīng)體系的配制，通過Prime ScriptTMRT 試劑盒檢測RNA 的濃度，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以β-actin 為內(nèi)參，按2-ΔΔCt法進行相對表達量分析。

1.2.3 流式細胞儀細胞凋亡檢測取對數(shù)生長期的細胞，轉(zhuǎn)染24 h 后接種到密度為3 × 105個/孔的6 孔板中，經(jīng)預(yù)冷的70%乙醇處理后，置于4 ℃溫度條件下過夜。加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL 碘化丙啶染色液（0.25 mg/mL），輕輕混勻，室溫避光孵育20 min，用流式細胞儀進行檢測。

1.2.4 雙熒光素酶報告將野生型（WT）或突變型（MUT）DBH-AS1 克隆到pmirGLO 質(zhì)粒受體中，同時將miR-138 mimics 或miR-138 inhibitors 導(dǎo)入293細胞中，共培養(yǎng)48 h 后采用雙熒光素酶受體分析系統(tǒng)測量雙熒光素活性。

1.2.5 Westrn blot 法收集轉(zhuǎn)染24 h 后的細胞，常規(guī)提取細胞總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度，SDS-PAGE 凝膠每孔加入40 μg 的待測蛋白，110 V電泳，250 mA 電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，分別加入HIF-1α、caspase-7 和β-actin 一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3×10 min，二抗37 ℃孵育1 h，TBST 洗膜3 × 30 min，ECL 顯影。運用Quantity one 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin作內(nèi)參，計算相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，P＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DBH-AS1在瘢痕疙瘩組織和瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達水平QRT-PCR結(jié)果顯示DBH-AS1在瘢痕疙瘩組織和成纖維細胞中明顯高于正常組織和正常成纖維細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染si-DBH-AS1 和LV-DBH-AS1 分別下調(diào)和上調(diào)瘢痕疙瘩成纖維細胞中的DBH-AS1 表達水平，見圖1。

2.2 低表達與過表達DBH-AS1 對成纖維細胞凋亡的影響流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-NC 和si-DBH-AS1 的瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡率分別為（6±1.2）%和（17±2.7）%，轉(zhuǎn)染si-DBH-AS1 明顯下調(diào)細胞中caspase-7 mRNA和蛋白表達水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而轉(zhuǎn)染LV-NC 和LV-DBHAS 瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡率分別為（5 ± 0.9）%和（1 ± 0.5）%，過表達DBH-AS 顯著上調(diào)caspase-7 mRNA和蛋白水平，見圖2。

圖1 DBH-AS1 在瘢痕疙瘩組織和瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達水平Fig.1 DBH-AS1 relative expression level in keloid tissues and keloid fibroblasts

圖2 低表達與過表達DBH-AS1 對成纖維細胞凋亡的影響Fig.2 Effects of low expression and overexpression of DBH-AS1 on apoptosis of fibroblasts

2.3 DBH-AS1能夠靶向結(jié)合miR-138雙熒光素酶報告顯示DBH-AS1 能作為海綿靶向結(jié)合miR-138，DBH-AS1 野生組轉(zhuǎn)染miR-138 mimics 后，雙熒光素活性顯著下調(diào)，而DBH-AS1 突變組無明顯變化。QRT-PCR 結(jié)果顯示miR-138 在瘢痕疙瘩組織和成纖維細胞均低于正常組織和正常成纖維細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染si-NC 和si-DBHAS1 的瘢痕疙瘩成纖維細胞中miR-138 相對表達量分別為（1.0±0.2）和（1.7±0.3），而轉(zhuǎn)染LV-NC和LV-DBH-AS1的miR-138相對表達量為（0.9±0.2）和（0.3±0.2），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 DBH-AS1 能夠靶向結(jié)合miR-138Fig.3 DBH-AS1 serves as a sponge of miR-138

2.4 過表達與低表達miR-138 對成纖維細胞細胞凋亡的影響流式細胞術(shù)結(jié)果顯示成纖維細胞轉(zhuǎn)染miR-NC 和miR-138 mimics 的細胞凋亡率分別為（7 ± 0.5）%和（19 ± 0.8）%，而轉(zhuǎn)染miR-NC 和miR-138 inhibitors 的細胞凋亡率分別為（15 ± 0.7）%和（6 ± 0.4）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。過表達和敲低miR-138 也會顯著上調(diào)或降低caspase-7 mRNA 和蛋白的表達水平，見圖4。

2.5 miR-138 能夠靶向結(jié)合HIF-1α雙熒光素酶報告顯示miR-138 能夠靶向調(diào)控HIF-1α，HIF-1α野生組轉(zhuǎn)染miR-138 mimics 后，雙熒光酶活性顯著低于轉(zhuǎn)染miR-NC 組，然而HIF-1α突變組無明顯差異。HIF-1α在疤痕疙瘩組織和正常組織中相對表達量分別為（1.0±0.2）和（2.1±0.8），轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-138 mimic 和miR-138 inhibitors 后，成纖維細胞中HIF-1α相對表達量分別為（1.0 ± 0.1）、（0.4 ±0.1）和（1.6 ± 0.2），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

2.6 DBH-AS1調(diào)控miR-138/HIF-1α通路參與細胞凋亡的影響回復(fù)實驗中，轉(zhuǎn)染miR-138 inhibitors能夠逆轉(zhuǎn)單獨轉(zhuǎn)染si-DBH-AS1 對瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡的影響，卻能夠進一步加強單獨轉(zhuǎn)染LVDBH-AS1 對成纖維細胞凋亡的影響（P＜0.05）。而轉(zhuǎn)染si-HIF-1α能夠逆轉(zhuǎn)單獨轉(zhuǎn)染miR-138 inhibitors 對成纖維細胞凋亡的影響，卻進一步加強單獨轉(zhuǎn)染miR-138 mimic 對瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡的作用（P＜0.05），見圖6。

3 討論

瘢痕疙瘩是一種病理性皮膚疾病，輕則影響皮膚外觀，重則導(dǎo)致畸形，出現(xiàn)各種皮膚功能性癥狀，然而疤痕疙瘩的形成機制尚不清楚［16-18］。研究表明大量lncRNA 在瘢痕疙瘩組織中均存在異常表達，然而lncRNA 在瘢痕疙瘩的研究還遠未深入［19-21］。本研究中DBH-AS1 在瘢痕疙瘩組織和成纖維細胞中都明顯上調(diào)，敲低DBH-AS1 能促進成纖維細胞凋亡，然而高表達DBH-AS1 顯著抑制細胞凋亡。這提示DBH-AS1 通過調(diào)控成纖維細胞凋亡參與瘢痕疙瘩的發(fā)生和進展，其具體機理需進一步探討。

miRNA 是一種長度僅有20～24 nt的微型RNA，生物體內(nèi)的miRNA 數(shù)量占RNA 總數(shù)的比例不足1.0%，但機體內(nèi)30%～50%的基因表達均與miRNA有關(guān)。研究表明miR-194-3p、miR-199a-5p、miR-29a和miR-1224-5p等miRNA在瘢痕疙瘩組織中存在異常表達［22-24］。JIE 等［14］的研究成果顯示LncRNA DBH-AS1 能靶向結(jié)合miR-138 參與肝細胞癌的腫瘤形成過程。本研究中，雙熒光素酶結(jié)果顯示DBH-AS1 能夠靶向結(jié)合miR-138，過表達miR-138促進成纖維細胞凋亡，而沉默miR-138 抑制細胞凋亡，這提示DBH-AS1 通過靶向結(jié)合miR-138 調(diào)控成纖維細胞凋亡。

圖4 過表達與低表達miR-138 對成纖維細胞細胞凋亡的影響Fig.4 Effects of overexpression and low expression of miR-138 on apoptosis of fibroblast cells

圖5 miR-138 能夠靶向結(jié)合HIF-1αFig.5 miR-138 can directly target HIF-1α

圖6 DBH-AS1 調(diào)控miR-138/HIF-1α通路參與細胞凋亡的影響Fig.6 DBH-AS1 participates in the effect of apoptosis by regulating the miR-138/HIF-1α pathway

HIF-1α是一種缺氧誘導(dǎo)因子-1α，葉飛輪等［25］發(fā)現(xiàn)HIF-1α可通過影響血管新生、炎癥反應(yīng)和細胞凋亡參與瘢痕疙瘩的形成。本研究中，雙熒光素酶結(jié)果顯示miR-138 能夠靶向結(jié)合HIF-1α，證實miR-138 能特異性靶向結(jié)合HIF-1α，HIF-1α在瘢痕疙瘩組織中的相對含量明顯高于正常皮膚組織，這說明miR-138 靶向結(jié)合HIF-1α參與成纖維細胞凋亡進程。進一步實驗證實lncRNA DBHAS1 能夠通過調(diào)控miR-138/HIF-1α信號通路參與成纖維細胞凋亡。

本研究首次發(fā)現(xiàn)lncRNA DBH-AS1可作為miR-138 海綿調(diào)控HIF-1α的表達，進而參與瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡，但僅考慮了體外細胞實驗，還缺乏體內(nèi)實驗加以驗證。因此，LncRNA DBH-AS1 能否應(yīng)用疤痕疙瘩的臨床治療還有待進一步驗證，但可為瘢痕疙瘩治療提供了新思路和新選擇。