粟粒型肺癌的腫瘤微環境及其與EGFR-TKI療效的關系

葉美鳳 蘇珊 岑文昌 張言斌

1廣州醫科大學（廣州511436）；2廣州市胸科醫院（廣州501595）

粟粒型肺癌是一種特殊類型的肺癌，主要表現為影像學上大量彌漫的、微小的（≤3 mm）的肺小結節，多為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）血行轉移形成［1］。文獻報道，絕大多數粟粒型肺癌為肺腺癌，且表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突變率高達70% ～86%［2-3］。近年來，EGFR 酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-tyrosine kinase inhibitor，EGFRTKI）在指南中被推薦為EGFR 突變的晚期NSCLC患者的首選一線治療。既往臨床研究顯示，接受EGFR-TKIs 治療的EGFR 敏感突變NSCLC 患者，中位無疾病進展時間（progression-free survival time，PFS）達到8 ～13個月，與傳統的一線化療4 ～6個月的中位PFS 相比，TKIs 展現出了極大的優勢［4-5］。有少數研究發現，粟粒型肺腺癌患者一線接受EGFR-TKI 治療的PFS 大約在4 ～8 個月［3，6］，預后明顯比非粟粒型肺癌差。但是，粟粒型肺癌患者接受靶向治療效果不佳的內在原因仍需進一步的研究。

腫瘤微環境是腫瘤細胞生存的內環境，不僅包括腫瘤細胞本身，還有其周圍的成纖維細胞、免疫和炎性細胞、膠質細胞等各種細胞，以及細胞間質、微血管等［7］。程序性死亡分子配體1（programmed death ligand 1，PD-L1），在多種腫瘤細胞中表達，與其受體程序性死亡分子PD-1（programmed death 1）結合可抑制腫瘤免疫效應［8］。TENG 等［9］根據PD-L1 的表達和腫瘤浸潤淋巴細胞（tumorinfiltrating lymphocytes，TIL）的狀態，將腫瘤微環境分成四種免疫表型，其中I 型腫瘤微環境中PD-L1高表達且存在大量CD8+TILs，因此被認為是免疫炎癥型的腫瘤微環境，對以PD1/PD-L1 通路為靶點的免疫治療響應。近年來有研究發現，腫瘤微環境可能還參與了靶向治療的耐藥。MASSI 等［10］發現，黑色素瘤微環境中的免疫抑制成分在BRAF 抑制劑反應改善中發揮重要作用。在肺癌中，MATSUMOTO 等［11］發現，微環境的免疫表型與EGFRTKI 療效密切相關。前期研究也證實，PD-L1 的表達陽性與EGFR-TKI 耐藥有關［12］。而既往研究發現，粟粒型肺癌患者，EGFR 突變幾率較高，且接受靶向治療效果不佳，這其中是否也有免疫因素的參與，目前尚不清楚。

因此，本回顧性研究通過免疫組化方法檢測粟粒型肺癌患者PD-L1 和CD8 的表達，擬明確粟粒型肺癌患者腫瘤微環境免疫表型的特點，并進一步探索其是否影響EGFR-TKI 的療效，為免疫因素參與靶向治療的耐藥提供新的理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象回顧性收集2017 年3 月至2019 年3 月廣州市胸科醫院收治的147 例EGFR 突變并接受EGFR-TKI 治療的IV 期NSCLC 患者。根據影像學是否表現為大量彌漫性的、微小的（≤3 mm）的肺小結節，將患者分為粟粒型肺癌組（A 組，49 例）和非粟粒型肺癌組（B 組，98 例）。納入標準：（1）經組織病理學確診為NSCLC；（2）病理學分期為Ⅳ期；（3）具有EGFR 基因突變；（4）組織標本足夠行免疫組織化學檢測；（5）病理確診后曾接受采用EGFR-TKI 治療。排除標準：（1）取得組織標本前曾接受過抗腫瘤治療；（2）合并其他腫瘤或嚴重疾病者。從醫院電子數據中收集患者性別、年齡、吸煙史、臨床分期、EGFR 突變類型等臨床基線特征。該研究已得到廣州市胸科醫院評審和倫理委員會批準，所有患者在參加本研究前均已獲得知情同意。

1.2 結果評估所有患者在接受EGFR-TKI 治療期間每3 個月進行一次胸部CT 檢查隨訪。根據實體腫瘤反應評估標準（RECIST）1.1 版確定治療反應和疾病進展的定義。無進展生存期（progression-free survival，PFS）被定義為從接受EGFR-TKI治療開始到疾病進展或死亡的時間。在最后一次隨訪中，如果沒有疾病進展（PFS），則對患者進行審查。

1.3 免疫組化染色所有腫瘤標本均為患者首診時通過活檢獲得。采用免疫組化法檢測腫瘤組織中PD-L1（22C3，Dako，Carpinteria，CA）及淋巴細胞CD8（C8/144B，上海基因科技有限公司，中國）的表達。所有的IHC 分析都由兩名經驗豐富且不知患者臨床信息的病理學家進行評估。PD-L1 表達采用3 級分級系統定義：≥50%為強陽性，1% ～49%為弱陽性，＜1%為陰性表達。CD8 陽性的標準為表達CD8 的淋巴細胞在腫瘤間質中所占的比例，＜10%為陰性，≥10%為陽性。

1.4 治療方法粟粒型肺癌組患者均接受過EGFR-TKI治療，其中一線治療40例（81.63%），二線治療9 例（18.37%）。接受EGFR-TKI 一線治療的藥物包括吉非替尼（13 例，32.5%）、埃克替尼（15 例，37.5%）、厄洛替尼（7 例，17.5%）和阿法替尼（5 例12.5%），二線治療包括吉非替尼（6 例，66.67%）、厄洛替尼（2例，22.22%）和阿法替尼（1例11.11%）。非粟粒型肺癌組患者均接受一線EGFR-TKI 治療，包括吉非替尼（41 例，41.84%）、埃克替尼（35 例，35.71%）、厄洛替尼（13 例，13.27%）和阿法替尼（9 例9.18%）。

1.5 統計學方法采用SPSS 22.0進行統計學分析及GraphPad Prism 8.0 繪圖。采用χ2檢驗評估粟粒型肺癌和非粟粒型肺癌患者間PD-L1 和CD8 表達以及治療反應的差異。采用χ2檢驗比較不同PD-L1表達患者的治療反應。采用Kaplan-Meier 法進行生存分析，并進行Log-rank 檢驗。采用Cox 回歸方法分析PFS 的預后因素。采用Logistic 回歸分析方法分析粟粒型肺癌的相關因素。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 入組患者的基線特征本研究共納入147 例EGFR 突變的NSCLC 患者，其中粟粒型肺癌組（A組）患者49 例，非粟粒型肺癌組（B 組）患者98 例。A組患者的中位年齡58歲，范圍為25 ～82歲。B患者的中位年齡63 歲，范圍為33 ～83 歲。A 組患者病理類型均為腺癌，B 組有96 例腺癌（98.0%），2例鱗癌（2.0%）。所有患者在接受治療前進行基因檢測。A組中1例患者治療前檢測到合并T790M 突變，B 組1 例患者合并T790M 突變，2 例PI3K 復制，1 例HER2 擴增，1 例ALK+突變，1 例ROS1 突變。所有患者的基線臨床資料平衡，兩組患者之間的年齡、性別、吸煙情況等基線特征差異均無統計學意義（均P＞0.05），但兩組的EGFR 突變分型差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組患者的臨床病理基線特征Tab.1 Clinicopathological baseline characteristics of patients in both groups例（%）

2.2 腫瘤微環境中PD-L1 的表達及其對EGFRTKI 療效的影響A 組和B 組患者PD-L1 表達的陽性率分別為40.82%（20/49）和24.49%（24/98），二者差異有統計學意義（P= 0.042）。A 組PD-L1陽性患者的中位PFS 為5.1 個月，明顯短于陰性患者的9.4 個月（P= 0.009）。B 組PD-L1 陽性和陰性患者的中位PFS 分別為7.0 和11.0 個月，二者之間差異有統計學意義（P=0.024），見圖1。

2.3 腫瘤微環境的免疫分型及其與EGFR-TKI療效的關系既往文獻報道［10］，根據PD-L1 和CD8的表達狀態，將腫瘤微環境分為4 種類型：Ⅰ型（PD-L1+/CD8+，適應性免疫抵抗）、Ⅱ型（PD-L1-/CD8-，免疫忽視）、Ⅲ型（PD-L1+/CD8-，內源性誘導）和Ⅳ型（PD-L1-/CD8+，免疫耐受）。A 組Ⅰ型免疫微環境的患者有12 例，占比24.49%，B 組有10 例，占比10.20%，二者之間差異有統計學意義（P=0.022）見圖2。A 組中I 型免疫微環境患者的中位PFS 為5.7 個月，其他型（Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ型）患者的中位PFS 為7.4 個月，二者之間差異有統計學意義（P=0.024）；B 組Ⅰ型微環境患者的中位PFS 為6.0 個月，其他型（Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ型）患者的中位PFS 為11.0 個月，二者之間差異有統計學意義（P= 0.027），見圖3、4。

圖1 腫瘤微環境中PD-L1 表達陽性和陰性患者的無進展生存曲線Fig.1 Progression-free survival curves of patients with positive and negative PD-L1 expressionin tumor microenvironment

圖2 粟粒型肺癌組和非粟粒型肺癌組患者的腫瘤微環境免疫表型比較Fig.2 Comparison of tumor microenvironmental immunophenotypes between miliary and non-miliary lung cancer group

3 討論

圖3 腫瘤微環境免疫表型與EGFR-TKI 療效的關系Fig.3 The relationship between tumor microenvironmental immunophenotype and the efficacy of EGFR-TKI

圖4 腫瘤微環境免疫表型不同患者的無進展生存曲線Fig.4 Progression-free survival curves of patients with different tumor microenvironmental immunophenotypes

粟粒型肺癌患者是一類特殊的肺癌人群，有研究顯示，其EGFR 突變率較高，接近80%左右［2］。部分研究報道，這類型肺癌患者接受EGFR-TKI治療的療效可能不佳［2，6］，但影響其療效的因素尚未明確。T790M 突變、C-MET 擴增以及組織學類型轉化是目前已知最常見的EGFR-TKI 的耐藥機制［13-14］，少數研究提出，腫瘤免疫微環境可能也參與了EGFR-TKI 的耐藥［11-12，15］。本研究通過大樣本量的回顧性分析，首次探討了粟粒型肺癌患者的免疫微環境及其與EGFR-TKI 療效的關系。本研究發現，粟粒型肺癌的PD-L1 呈高表達狀態，“炎癥型”免疫微環境的比例較高，且呈炎癥型免疫微環境的患者接受EGFR-TKI 治療的療效較其他類型的免疫微環境差，提示炎癥型免疫微環境可能是粟粒型肺癌患者靶向治療療效差的原因，且該部分患者可能從免疫治療中獲益。

有研究顯示，EGFR 信號可通過激活ERK、AKT-mTOR、STAT3 通路上調PD-L1 的表達［16-17］。但免疫表型與EGFR 狀態的關系尚未完全清楚。MATSUMOTO 等［11］和LIU 等［18］的研究發現，EGFR陽性NSCLC 患者Ⅰ型免疫微環境分別占13.5%和5%，均為四種免疫表型中最低的。與以往的研究結果相似，本研究中非粟粒型肺癌患者亦為Ⅰ型免疫表型最少（10.2%），然而粟粒型肺癌患者達到24.49%，顯著高于非粟粒型肺癌患者。目前粟粒型肺癌呈炎癥型免疫微環境的原因尚不明確，可能與肺癌的血行轉移或PD-L1 表達的動態變化相關，仍需進一步研究來闡明。

越來越多的證據表明，免疫因素與EGFR-TKI的耐藥密切相關［12，19］。ZHANG 等［20］在動物實驗中發現PD-L1 可能通過激活TGF-β/Smad 通路誘導上皮間質轉化（EMT），從而促進EGFR-TKI 的原發耐藥。目前多個研究發現NSCLC 患者EGFRTKI 療效不佳與PD-L1 的陽性表達相關。本研究發現PD-L1 陽性表達的肺癌患者PFS 顯著縮短，與既往研究結果一致。

LIU 等［18］通過大樣本量的研究分析了EGFR突變或ALK 重排患者的PD-L1 表達和CD8+TILs 的狀態之間的相關性，發現聯合CD8+TILs 比單獨的PD-L1 表達更能預測肺腺癌患者的預后。TENG等［9］基于PD-L1 的表達與CD8+TILs 的狀態將腫瘤微環境分為四種免疫表型。MATSUMOTO 等［11］分析了四種不同腫瘤微環境免疫表型與EGFR-TKI療效的相關性，結果提示，Ⅰ型腫瘤微環境的PFS在四種類型中最短。前期研究也發現［12］，EGFRTKI 原發性耐藥患者的PD-L1/CD8 雙陽性表達比例較高，因此推測PD-L1 和CD8+TILs 表達可能與EGFR-TKI 耐藥相關。本研究納入了晚期EGFR 突變且接受EGFR-TKI 治療的49 例粟粒型肺癌和98 例非粟粒型肺癌患者進行分析，發現兩組患者中呈Ⅰ型腫瘤微環境的患者PFS 均短于其他類型的患者，進一步驗證了Ⅰ型腫瘤微環境參與了EGFR-TKI 的耐藥。本研究進一步對比了粟粒型肺癌與非粟粒型肺癌免疫微環境的差異，結果顯示，粟粒型肺癌患者呈Ⅰ型腫瘤微環境的比例顯著高于非粟粒型肺癌患者（24.49%vs. 10.20%，P=0.022）。因此推測免疫微環境可能是影響粟粒型肺癌接受EGFR-TKI 治療療效的重要因素，且這類患者出現EGFR-TKI 耐藥后可能受益于免疫治療。但是粟粒型肺癌、免疫微環境與EGFR-TKI 耐藥之間相互作用的具體機制仍需要進一步的基礎研究來探索和驗證。

本研究仍存在一些局限性。一方面，本研究為回顧性的單中心研究設計，可能存在選擇偏倚。另一方面，本研究未對EGFR-TKI 耐藥后的粟粒型肺癌患者進行下一代基因測序，因此，難以明確是否存在其他未知的潛在的耐藥機制影響了EGFR-TKI 的療效，也無法從免疫信號通路方面，深入研究免疫因素影響EGFR-TKI 耐藥的分子機制。

綜上所述，本研究表明炎癥型免疫微環境可能是影響粟粒型肺癌患者EGFR-TKI 的療效不佳的原因之一。因此，免疫治療或是粟粒型肺癌EGFR-TKI 耐藥后的可選擇的治療策略。