回回甘松飲對糖尿病腎病大鼠miR-192及TGF-β1/Smads的調控作用

袁玲 李嘉欣 魯玉梅 南一，3

寧夏醫科大學1藥學院藥理學與毒理學系，2中醫學院中醫內科學系（銀川750004）；3回醫藥現代化教育部重點實驗室（銀川750004）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是臨床常見的慢性腎功能衰竭的主要原因，近半數DN 患者最終進展為終末期腎病［1］。腎功能受損后，隨著尿白蛋白排泄增加，腎小球細胞外基質（extracellular matrix，ECM）堆積，腎小球硬化及腎小管纖維化逐步加重［2］。臨床上以控制血糖和血壓為主要治療手段，但治療效果并不理想［3］。近年來，中醫藥在DN 的防治中起到了很好的輔助及有效的治療作用［4-5］，利用現代藥理學的研究手段和方法可進一步闡明中醫藥的藥理作用機制。而微小RNA（microRNA，miRNA）的發現為DN 的分子機制研究提供了新的切入點［6］。多項臨床研究通過分析白蛋白/肌酐比率、腎小球濾過率及微量白蛋白，證實miR-192 可以反映DN 的發病機制［7］，并在DN 進展過程中可作為生物標志物［8］。miR-192 可能是腎臟病理改變過程中TGF-β1/Smads 信號傳導通路的重要下游介質［9］，通過其特異性靶點直接與DN 病變聯系［10］。有學者通過在體及離體實驗均發現某些與補腎功效相關的中藥可通過TGF-β1/Smad/miR-192 信號通路抑制系膜細胞過度增殖，減少腎臟ECM 堆積，改善腎纖維化的病理變化［11-12］，也有研究發現通過調控miR-192 可有效的治療糖尿病腎病［13］。

回回甘松飲（Hui-hui Gan-song Yin，HGY，國家發明專利：ZL201310205739.1），以“香藥”為用藥特色，藥物組成方面選用甘松、木香、藿香等芳香化濁的香藥。前期研究已發現在HGY 干預后，DN 大鼠的血糖、血脂、腎功能及腎臟的病理等指標較DN 模型組均有顯著改善［14-15］，HGY 含藥血清對高糖誘導的腎小球系膜細胞的活力和細胞周期均有影響，可通過調控TGF-β1/Smads 信號通路干預高糖誘導的腎小球系膜細胞［16］，通過調控LncRNAPVT1 信號通路干預腎足細胞［17］，并可通過調控miR-21 改善自發性2 型糖尿病ZDF 大鼠早中期腎纖維化的損傷程度［18］。故本研究利用互聯網miRNA 軟件（TargetScan、miRanda 和PICTar 等）在線服務站點，通過預測作用靶基因，并結合NCBI檢索、綜合分析，研究HGY 對早期DN 大鼠miR-192 及相關信號通路的調控作用，以為臨床防治DN 提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物清潔級健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠50只，8 ～10周齡，體質量（200±20）g，由北京大學醫學部實驗動物科學部提供，SD 大鼠動物許可證編號為SCXK（京）2011-0012。本次實驗所使用的SD 大鼠以及實驗環境均符合《實驗動物管理條例》（國家科學技術委員會）要求。實驗期間，大鼠自由飲水攝食。動物飼養區域溫度設置為22 ～23 ℃，室內相對濕度為55%～60%，空氣流通。

1.2 藥品與主要試劑回回甘松飲的藥物組成是按照已授權的國家發明專利（批準文號為ZL201310205739.1）的配方和比例，包括甘松、藿香、茴香、丁香、木香、紅花、大黃、枸杞、人參、肉蓯蓉、菟絲子、松蕈、蘆薈，比例為10∶15∶12∶9∶6∶3∶5∶10∶5∶8∶15∶10∶5，中藥飲片由寧夏醫科大學附屬中醫醫院制劑室經水煎、過濾、濃縮后分別制成生藥濃度為0.5 g/mL 及1 g/mL 濃縮藥液。格列喹酮片（30 mg/片，國藥準字：H10940258，北京萬輝雙鶴藥業有限責任公司，產品批號為1120536）溶于蒸餾水后，制成格列喹酮濃度為1 mg/mL 的混懸液。鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ，美國Sigma 公司，貨號S0130）；枸櫞酸（北京化學試劑公司）；枸櫞酸三鈉（北京化學試劑公司）；定量PCR 及miRNA引物（北京閱微基因技術有限公司）；KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix（2X）試劑盒（美國KAPA Biosystems 公司，貨號KK4601）；TIANScript RT 試劑盒（天根生物科技有限公司，貨號KR104-02）；TGF-β1 抗體（美國Abcam 公司，貨號ab92486）；Smad3 抗體（美國Abcam 公司，貨號ab28379）；Smad7 抗體（美國Epitomics 公司，貨號3894-1）；SIP1 抗體（美國Santa 公司，貨號sc-48789）；GAPDH 抗體（美國Abcam 公司，貨號ab9485）；Rnase 抑制劑（美國Invitrogen 公司，貨號AM2694）。

1.3 主要儀器XP205 分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；TS-2000A 多用脫色搖床（江蘇其林貝爾儀器制造有限公司）；電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；Fresco17 低溫冷凍離心機（美國Thermo Scientific 公司）；NAS-99 微量分光光度計（美國ACTGene 公司）；MultiSkan3 酶標儀（美國Thermo Scientific 公司）；7900HT Fast 實時熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）。

1.4 模型制備以普通大鼠維持飼料（碳水化合物60%、蛋白質22%、脂肪4%）喂養，1 周后，選取50 只健康狀況良好的大鼠，作為實驗研究對象。隨機將其中的10 只大鼠作為空白對照組（NC），用普通大鼠維持飼料繼續喂養，其余40 只大鼠給予含糖44.4%、脂類22.3%、蛋白質18.6%的高糖高脂飼料喂養。4周后，禁食12 h，將上述40只大鼠腹腔注射STZ（55 mg/kg），NC 組的10只大鼠腹腔注射等量枸椽酸鈉緩沖液。DM 造模成功標志為：STZ注射72 h 后，連續兩次隨機血糖值≥16.7 mmol/L。DM 大鼠以高糖高脂飼料繼續喂養6 周，當隨機血糖≥16.7 mmol/L、尿糖+++以上、尿量為DM 造模前150%以上、MAU ＞400 μg/24 h、腎臟出現MogensenⅢ期病理改變時，說明早期DN 大鼠造模成功。

1.5 動物分組將早期DN 造模成功的大鼠隨機分為4 組：DN 模型組（DN）、HGY 高劑量組（DN+HH，10 g/kg）、HGY 低劑量組（DN+HL，5 g/kg）及格列喹酮組（DN+Gli，10 mg/kg），每組10 只大鼠。各給藥組的給藥量按照大鼠與人體表面積系數進行換算（相當于人用藥劑量的6 ～10 倍），并以等體積（10 mL/kg）的蒸餾水分別灌胃給予NC 組和DN 組，每日1次，連續灌胃8周，均以普通飼料喂養大鼠。

1.6 檢測方法

1.6.1 Western blot 法檢測大鼠TGF-β1、Smad3、Smad7及SIP1蛋白的表達將腎皮質均質化，研磨后加入蛋白裂解液，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min。吸收蛋白質溶液，并使用考馬斯亮藍（1∶4）定量檢測組織中TGF-β1、Smad3、Smad7 和SIP1 蛋白含量。將含有30 μg 蛋白的樣品在12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離并電轉移到PVDF 膜上。轉膜后，37 ℃封閉2 h。與特異性抗體在4 ℃孵育過夜，與辣根過氧化物酶標記二抗IgG（1∶1 000）進行反應，顯影后，定量分析該條帶。

1.6.2 實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）檢測大鼠miR-192的表達及TGF-β1、Smad3、Smad7、Zeb2 mRNA 的表達使用Trizol試劑（Invitrogen，USA）分離來自腎臟的總RNA。使用逆轉錄系統（Thermo Scientific，Lithuania）將RNA 用于第一鏈cDNA 合成。使用熱循環儀（ABI system，USA）通過以下步驟進行PCR 擴增：在94 ℃變性2 min，然后在94 ℃變性30 s，退火30 s 并在72 ℃下保持1 min，延伸30 個循環。循環結束后，在72 ℃再延伸10 min 后結束PCR，通過2-ΔΔCt方法計算mRNA 相對表達量。引物序列設計見表1。

表1 引物設計Tab.1 PCR-primer design

1.7 統計學方法統計學數據處理采用SPSS 18.0軟件比較分析，數據以均數±標準差的方式表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）的方法，進行多組間數據比較，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腎組織TGF-β1、Smad3、Smad7、SIP1蛋白表達采用Western blot 方法檢測各組大鼠腎組織發現：與NC 組相比，DN 組大鼠TGF-β1 和Smad3 蛋白表達明顯增加（P＜0.01），而Smad7 和SIP1 蛋白表達明顯減少（P＜0.01）；與DN 組相比，給予HGY 及格列喹酮干預后，大鼠TGF-β1 水平顯著下降（P＜0.01），Smad7 和SIP1 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01 或0.05），HGY 與格列喹酮組結果趨勢相近，見圖1。

2.2 各組大鼠腎組織miR-192 及Zeb2、TGF-β1、Smad3、Smad7mRNA 表達與NC 組相比，DN 組大鼠腎組織中miR-192、TGF-β1 mRNA 及Smad3 mRNA 的表達顯著增加（P＜0.01），而Zeb2 mRNA和Smad7 mRNA的表達顯著減少（P＜0.01）。與DN組相比，進行HGY 和格列喹酮干預后，大鼠Zeb2和Smad7 mRNA 的表達水平顯著上升（P＜0.01），miR-192 及TGF-β1、Smad3 mRNA 的表達水平明顯下降（P＜0.05），HGY 與格列喹酮對照組作用趨勢相近，見圖2。

圖1 各組大鼠腎組織TGF-β1、Smad3、Smad7、SIP1 蛋白的表達Fig.1 Expression of TGF-1，Smad3，Smad7 and SIP1 proteins in renal tissues of rats in each group

圖2 各組大鼠腎組織miR-192、Zeb2mRNA、TGF-β1mRNA、Smad3mRNA、Smad7mRNA 表達Fig.2 Expressions of mir-192，Zeb2mRNA，TGF-1mRNA，Smad3mRNA and Smad7mRNA in renal tissues of rats in each group

3 討論

DN 的病因非常復雜，其發病機制尚未完全闡明，本研究以高糖高脂高熱量飲食誘發大鼠胰島素抵抗，通過注射大劑量的STZ，一次性破壞胰島功能，復制DM 模型，再繼續喂以高糖高脂高熱量飲食，導致腎臟并發癥出現，其發病過程和特征與人類DN 相似。

在DN 發病過程中，腎組織中ECM 的關鍵調節因子TGF-β1 的含量會明顯增加［19］，它既可以刺激和增加ECM 蛋白的合成［20］，還可以減少ECM 的降解［21］。二聚體形式的TGF-β1 具有生物活性，且表現最為活躍［22］。Smads 蛋白在TGF-β受體下游，是其重要的信號轉導因子。在DN 發生過程中［23］：Smad2或Smad3磷酸化后發揮正性調節作用，Smad7在TGF-β1/Smads 信號通路中主要發揮著負性調控作用，Smad3 的磷酸化作用可以被Smad7 所抑制。Smad 相互作用蛋白1（Smad interacting Protein l，SIP1），其基因名稱為Zeb2，它可以和Smad1、Smad5、Smad3、Smad2 及Smad7 結合，并發生相互作用，它也是TGF-β家族成員的基因轉錄抑制因子［24］。

本研究發現在HGY干預后，DN大鼠腎臟TGFβ1的表達受到抑制，Smad3的表達降低，Smad7的表達升高。如前所述，調控TGF-β1/Smads 信號通路可有效的抑制或減少ECM 的堆積，這就不難解釋在早期動物實驗研究中的結果［14］：HGY 可以一定程度上延緩和減輕DN 大鼠早期出現的腎小球肥大，腎小球基底膜增厚，腎小囊腔變窄，系膜區增寬，系膜基質彌漫性增生等腎臟病理改變。我們在前期離體實驗研究中發現［25］：HGY 含藥血清可以干預調控高糖誘導的腎系膜細胞中纖維連接蛋白及Ⅰ型、Ⅳ型膠原蛋白表達水平，這些蛋白是ECM 的主要成分，因而本研究結果與前期離體實驗研究結果是一致的。

miRNA 的發現為研究DN 的分子機制提供了新的切入點。KATO 等［26］人最早研究發現，miRNA-192 在腎小球系膜細胞中表達，對腎小球系膜細胞起到至關重要的作用。miR-192 是在高糖誘導的腎小球系膜細胞中最早被發現且表達量最多的miRNA 之一。對靶序列綜合分析后發現：Zeb2 是miR-192 預測的靶基因［27］。更有趣的是，SIP1 又是Zeb2 在蛋白水平的表達形式，所以SIP1 是miR-192的一個靶標，miR-192 負調節Zeb2，Zeb2 正調節SIP1。miR-192 可通過其特異性靶點直接與DN 病變聯系，顯示了雙重作用，即：可能通過“TGF-β1/Smad 信號通路”（ECM 堆積）和“TGF-β1/CTGF 信號通路”（E-cadherin 堆積）兩條信號通路來延緩2型DN 的進展，保護腎功能［28］。

HGY 干預后，SIP1 表達增多，而SIP1 是作用于Smads 之間的蛋白，Smads 蛋白反向抑制TGF-β1 表達，這樣就形成了一個以SIP1 為核心因子的調控網絡。本研究發現，HGY 干預后，miR-192 表達降低，Zeb2 表達升高，并對TGF-β1/Smads 信號通路發揮了重要的調控作用，推測可能與miR-192 與靶基因Zeb2 結合相關，通過SIP1 蛋白有效介導TGFβ1/Smads 信號通路，發揮保護腎臟的作用，HGY 的這種藥理機制與改善和治療DN 的一些藥物具有相似之處［29］。HGY 的藥物組成多為含有揮發油成分的香藥，這種治療方法曾在幾千年前的《黃帝內經·素問》奇病論關于消渴（糖尿病）的治療中提出過，但在近代并不多見。所以本研究的發現，不僅可以為臨床改善和治療DN 提供合理有效的藥物，而且為深入研究中醫藥理論有關糖尿病的治法“治之以蘭，除陳氣也”開拓思路，提供研究基礎。

盡管本研究結果可以合理解釋HGY 前期的藥理作用，但本研究所采用的動物模型屬于化學藥物損傷方法，相對于疾病本身存在著局限性。故在充分論證本研究結果基礎上，我們有理由在后續的研究中應用自發性DM 模型，如：Zucker 大鼠、GK 大鼠等進一步驗證HGY 的藥效及藥理機制，并合理借鑒KATO 等［30］的研究方法，進一步論證HGY的藥理作用。