重癥肺部感染患者肺泡上皮襯液萬古霉素滲透性研究*

孫堯，傅源源，周蘇明，羅璨

(1.南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院藥學部，南京 210009；2.南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥學部，南京 210029 )

重癥肺炎是入住重癥監(jiān)護病房(intensive care unit，ICU)及老年患者死亡最重要原因之一，病死率30%～50%[1]。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)是引起醫(yī)院獲得性肺炎(hospital acquired pneumonia，HAP)的主要病原菌之一，由于耐藥菌株不斷產生，臨床上常用萬古霉素進行治療[2-3]。近年來，萬古霉素治療MRSA引起的重癥肺炎等疾病的有效性受到質疑?？咕幬锬苓_到感染組織部位的實際濃度，抗菌清除效果及臨床療效都有著決定性的關系。對于肺部感染，抗菌藥物在肺泡上皮襯液(epithelial lining fluid，ELF)中是否能夠達到有效的濃度，影響著其實際的臨床療效及患者的病情轉歸。越來越多研究開始關注治療過程中靶組織的藥物濃度，并嘗試通過測定感染部位的實際藥物濃度，優(yōu)化抗菌藥物的給藥方案、預測臨床療效，以實現個體化的精準藥物治療，最終達到精準醫(yī)療的目的。筆者在本研究選取入住ICU診斷為肺部感染、采用機械通氣同時使用萬古霉素治療的重癥患者，通過液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)法，測定患者用藥后支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中藥物濃度，根據RENNARD等[4]所建立的尿素稀釋法，計算ELF中實際藥物濃度，并與同期血藥濃度進行對比，以探究萬古霉素在肺部組織的滲透性，為臨床上使用萬古霉素進行肺部感染治療的給藥方案調整提供支持依據。

1 資料與方法

1.1臨床資料 2016年5月—2017年1月，入住南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院老年ICU患者。患者需符合所有入選標準，并且不符合任何一條排除標準。入選標準：①確診肺部感染；②如培養(yǎng)出敏感菌或經驗性治療需要使用萬古霉素；③急性生理及慢性健康 (APACHE II)評分>15分；④氣管插管或氣管切開，使用呼吸機進行輔助呼吸；⑤需要進行支氣管鏡檢、肺泡灌洗或相應治療；⑥病程中有明確的病原分離及藥敏結果。排除標準：①年齡<18歲；②急性或慢性腎衰竭，肌酐清除率(ClCr)<40 mL·min-1；③用藥期間進行血漿置換或體外膜肺氧合(extracorporeal membrane oxygenation，ECMO)或持續(xù)性腎臟替代治療(continuous renal replacement therapy，CRRT)患者；④孕婦或正在哺乳的婦女、燒傷以及囊性纖維病患者；⑤由于治療無效或發(fā)生嚴重藥物不良反應導致中途停藥的患者；⑥癲或患有精神系統(tǒng)疾病的患者；⑦對萬古霉素或其他糖肽類藥物具有過敏史的患者；⑧獲得性人免疫缺陷病毒(HIV)感染或有其他嚴重傳染性疾病的患者。

1.2治療方法 治療藥物：注射用鹽酸萬古霉素(商品名：穩(wěn)可信，Eli Lilly & Co，注冊證號：H20030375，規(guī)格：每瓶500 mg)。給藥方法：萬古霉素0.5 g，溶于0.9%氯化鈉注射液100 mL，q8h，所有患者均采用自動輸液泵進行給藥，給藥維持時間為1 h持續(xù)泵入，給藥前對輸液泵進行校準以確保所有藥液在1 h內準確輸注完畢。同時記錄患者用藥時間，給藥開始以及結束時間，所用萬古霉素的產品批號。

1.3樣本及患者信息采集 樣本采集：選取符合入選標準患者，于使用萬古霉素第3天，不同患者分別于一個給藥間隔內某個時間點(給藥開始后1，1.5，2.5，4.5，7.5 h)進行支氣管肺泡灌洗及血樣采集。灌洗操作參考THOMAS等[5]方法：將纖維支氣管鏡從氣管插管患者的插管接口處進入，下至右肺中葉楔段，局部給予1%利多卡因10 mL麻醉，將無菌0.9%氯化鈉溶液200 mL分4份，每份50 mL，從纖維支氣管鏡上端注入，立即(30 s內)抽吸，回收肺泡灌洗液于痰液收集器中，并立即置于冰上。首次抽吸出50 mL回收液丟棄，因其中含有臨近氣道的細胞、痰液及分泌物等，收集剩下3次回收的灌洗液，合并至同一容器，檢測萬古霉素和尿素的濃度。支氣管肺泡灌洗操作的同時，抽取靜脈血2 mL，置于黃色促凝采血管中，檢測血中萬古霉素和尿素的濃度。

患者信息采集：分別記錄患者的姓名、性別、年齡、身高、體質量、體質量指數(BMI)、肝腎功能、APACHE II 評分、臨床肺部感染(CPIS評分)、入院及出院診斷等一般人口學資料。并記錄患者合并的基礎疾病、合并用藥、用藥時間、住院時間等。記錄患者除肺部感染之外有無合并其他感染、急慢性肝腎功能衰竭等。記錄有無藥物不良反應發(fā)生、并統(tǒng)計用藥前后患者的白細胞計數(WBC)、中性粒細胞百分比(N %)、C 反應蛋白(CRP)、降鈣素原(PCT)等感染指標，對用藥期間所做的細菌培養(yǎng)及藥敏試驗結果進行記錄。

1.4濃度測定及計算方法

1.4.1萬古霉素在血漿和肺泡灌洗液中濃度測定 采用LC-MS/MS法進行檢測，采用Thermo Hypersil GOLD C18(100 mm×2.1 mm，3 μm)色譜柱，流動相為甲醇-水(含0.1%甲酸)進行梯度洗脫，流速：300 μL·min-1，柱溫：25 ℃，保留時間：6.5 min；質譜檢測離子源為ESI+電噴霧，檢測方法：正離子模式，掃描方法：多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)，離子通道設定為萬古霉素m/z725.5→144.1，甲氨蝶呤(MTX，內標)m/z455.2→308.2，毛細管電壓：4000 V，氣流溫度：350 ℃，氣流流速：9 L·min-1，電噴霧壓力：35psi[5]。

1.4.2尿素在血漿和肺泡灌洗液中濃度測定 尿素的測定參考文獻[6-7]方法，使用尿素測定試劑盒，利用尿素酶-谷氨酸脫氫酶法[8]，尿素在脲酶的作用下水解產生氨離子和二氧化碳，氨離子在堿性介質中與酚顯色劑生成藍色的物質，該物質的生成量與尿素含量成正比，在波長640 nm比色測定。

2.4.3萬古霉素在ELF中濃度計算 根據RENNARD等[4]所建立方法，通過纖維支氣管鏡進行支氣管肺泡灌洗，所獲得的肺泡灌洗液實際上是0.9%氯化鈉溶液稀釋的ELF。而尿素作為一種非極性的小分子，可以自由通過肺泡壁，由此認為尿素在血液和ELF中濃度是相似的，那么就可以通過測定血中的尿素濃度，以及BALF中尿素濃度，以此作為稀釋倍數，計算ELF中實際的藥物濃度。

VELF=VBALF×[U]BALF/[U]ELF(1)

其中VELF為ELF的體積，VBALF為BALF的體積，[U]BALF為BALF中尿素濃度，[U]ELF為ELF中尿素濃度。

ELF中藥物濃度([D]ELF)計算如下：

[D]ELF=[D]BALF×(VBALF/VELF) (2)

其中，[D]BALF是BALF中藥物濃度，將(1)代入(2)可得：[D]ELF=[D]BALF×([U]ELF/[U]BALF)。因此，測定肺泡灌洗時血液中和回收BALF中尿素濃度，以及BALF中藥物濃度即可根據尿素稀釋倍比關系計算ELF中藥物的實際濃度。

1.5滲透性計算 萬古霉素對肺組織的滲透性，以藥物在ELF中濃度與血液中藥物濃度比值表示。

2 結果

2.1患者基本信息 本研究共收集符合入選標準患者19例，剔除患者3例，其中1例為使用萬古霉素<3 d即停藥換用其他抗菌藥物，1例家屬拒絕簽訂知情同意書，1例腎功能不全(ClCr=32 mL·min-1)。最終收集符合納入條件患者16例。所有患者均接受萬古霉素0.5 g，q8h的方法給藥。入組患者平均年齡(60.94±15.95)歲，平均體質量(71.77±7.59)kg，平均BMI偏高，為(25.20±3.11) kg·(m2)-1。診斷均為肺部感染，部分患者合并血流感染或腹腔感染等。APACHE Ⅱ評分平均為(30.31±4.47)分。納入的16例患者中，用藥前腎功能正常10例，其中ClCr>150 mL·min-1的4例，腎功能受損6例。住院期間死亡2例，主要死亡原因為多器官功能障礙綜合征。所有患者入科最初24 h的人口統(tǒng)計學資料及臨床資料見表1。

2.2臨床感染相關指標 16例患者用藥前后感染指標見表2。用藥后患者感染指標均有所下降，結果表明，白細胞計數和PCT的下降差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3微生物學結果 入組患者用藥期間細菌培養(yǎng)結果見表3。培養(yǎng)來源均為痰液或肺泡灌洗液，標本采集方式為使用吸痰管經氣道吸引，或使用纖維支氣管鏡經肺泡灌洗收集，標本采集時間為萬古霉素使用后1～3 d內，共檢出菌株43株，其中革蘭陰性菌為25株，占58.1%。鮑曼不動桿菌為最常見的菌株，占18.6%。其次為肺炎克雷伯菌(14.1%)、金黃色葡萄球菌(11.6%)和銅綠假單胞菌(11.6%)。所有檢出菌株中，對萬古霉素敏感的菌株13株(13例患者)，其中金黃色葡萄球菌5株，凝固酶陰性葡萄球菌3株(未行菌種鑒定)，頭狀葡萄球菌2株，及人葡萄球菌、表皮葡萄球菌、伊麗莎白金菌各1株(納入其他類)。有3例患者無病原學結果，為經驗性使用萬古霉素進行治療。

2.4藥物在肺組織的滲透性結果 支氣管肺泡灌洗的樣本采集結果及藥物濃度測定結果見表4。灌洗時回收灌洗液體積平均為58.25 mL，回收率27%～46%。

表1 16例患者基本資料

表2 16例患者用藥前后感染指標變化

表3 微生物學結果

肺泡灌洗的時間點分布在整個給藥間隔內，其中給藥開始后1 h采樣2例，1.5 h采樣4例，2.5 h采樣4例，4.5 h采樣4例，7.5 h采樣2例。不同時間點灌洗液濃度及灌洗液藥物濃度-時間曲線見圖1。灌洗液中萬古霉素濃度43.86～359.16 ng·mL-1，其濃度變化趨勢與血藥濃度變化趨勢，經Spearman相關性檢驗，P=0.001(小于0.05)，變化趨勢具有相關性。尿素在灌洗液中的稀釋倍數約37.34倍，利用Renard公式計算ELF中萬古霉素的濃度1.48～10.15 μg·mL-1，低于血藥濃度，其滲透率為8.4%～47.13%，平均為23.12%，與類似研究的結果基本一致[5，10，14]。4例腎功能亢進(ClCr>150 mL·min-1)患者的滲透率(18.89±2.73)%，其他患者(24.54±11.02)%，比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，2例死亡患者的滲透率(18.19±3.23)%，與存活患者的滲透率(23.83±10.33)%比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討論

傳統(tǒng)的抗感染藥物治療通常關注血藥濃度和微生物二者之間的關系，隨著精準藥物治療的推廣，越來越多研究發(fā)現藥物在靶組織達到的實際濃度較血藥濃度更有治療意義。與血藥濃度比較，感染的治療效果與抗菌藥物在感染組織部位的實際濃度更為相關，而且大多數藥物濃度檢測基本上都是通過血藥濃度來推測組織濃度，沒有具體的組織濃度檢測值推薦。對于肺部

表4 16例患者的灌洗液藥物濃度測定結果

圖1 不同時間點血藥-灌洗液藥物濃度

感染來說，胞外病原菌主要存在于ELF中[1]，抗菌藥物在此處聚集的濃度決定抗感染治療的效果，因此，近年來研究開始對藥物在ELF中的濃度進行測定，一方面是為了解藥物對肺組織的滲透性，另一方面探討肺部組織濃度與臨床治療效果的相關性，用以優(yōu)化現有的抗菌藥物方案。萬古霉素已經上市50多年，盡管對其臨床應用的研究眾多，但大部分為不同病理生理狀態(tài)下血藥濃度的測定和群體藥動學分析，而對于肺組織的滲透性研究，以及肺組織藥物濃度與臨床療效相關性的研究很少。

支氣管肺泡灌洗可以通過注入0.9%氯化鈉溶液抽吸回收的方法，間接獲得稀釋的ELF，是臨床較為安全、方便的獲得ELF的方法。目前尚未建立公認的肺泡灌洗采樣的支氣管鏡檢和灌洗標準操作規(guī)程，本研究中的肺泡灌洗操作參考大量以往的研究并結合ICU臨床經驗，給予無菌0.9%氯化鈉溶液200 mL分4次注入灌洗，首次50 mL丟棄，且均由ICU同一醫(yī)師進行操作，減少由個體間差異導致的系統(tǒng)誤差。灌洗液在肺內停留時間參考先前的各項研究[5，10-11]，選擇注入0.9%氯化鈉溶液后立即(30 s之內)抽吸出，計算得ELF的稀釋倍數為17.8～79，與先前的研究基本一致。研究表明不同的停留時間，可自由擴散的小分子物質被不同程度地稀釋，導致回收的灌洗液中尿素濃度受到影響，立即抽吸可盡量減少自由擴散帶來的誤差。通過支氣管肺泡灌洗獲得樣本的操作受到很多因素的影響，首先應保證患者給藥方法保持一致，本研究均采用輸液泵，60 min持續(xù)靜脈泵入，于采樣前30 min內做好肺泡灌洗準備工作，以確保在準確的時間點獲得樣本。樣本采集的操作標準和人員始終保持一致，以減少誤差。

很多研究對臨床常用的抗菌藥物對肺部滲透性進行測定，給藥方法包括口服和靜脈滴注，目標人群通常為健康志愿者或普通患者。總體來說，對于β-內酰胺類、糖肽類藥物，其對肺組織的滲透率<100%，臨床使用時需要根據血藥濃度估算組織部位實際到達濃度，并結合PK/PD參數、敏感菌的最低抑制濃度(MIC)等綜合考慮調整給藥方案；而對于喹諾酮類、利奈唑胺等，其肺組織中藥物濃度通常能達到血藥濃度的幾倍甚至幾十倍(滲透率>100%)，這類藥物更多地聚集在肺組織，能起到較好的抗菌效應，但對血流感染仍需根據實際情況進行調整。

對嚴重肺損傷患者進行藥物對肺部組織穿透性的研究發(fā)現，靜脈給予萬古霉素后測得肺組織內實際藥物濃度要低于血清中的藥物濃度[2-3]。對10例上呼吸機重癥肺炎患者給予常規(guī)劑量萬古霉素30 mg·kg-1，每天1次，于給藥后24 h測定血清藥物濃度及谷濃度下的ELF中藥物濃度[4]，結果顯示，10例患者中4例血清藥物濃度>20 mg·mL-1，其ELF中可以檢測到萬古霉素。這些研究都顯示萬古霉素對肺部的滲透性較小，對肺組織部位藥物濃度進行檢測，能夠幫助醫(yī)生了解其實際感染部位能夠達到的藥物濃度，從而根據藥物的PK/PD特點來優(yōu)化給藥方案，使感染部位的組織濃度達到有效治療范圍內，以獲得更好的臨床療效。

本研究中，萬古霉素在ELF中的濃度在一個給藥間隔內范圍為1.48～10.15 μg·mL-1，灌洗同時血藥濃度為8.71～61.96 μg·mL-1，平均滲透率為23.12%，滲透率較低。LODISE等[5]針對于10名健康志愿者測定其ELF中萬古霉素的濃度，靜脈給藥萬古霉素1 g，q12h，給藥9次后進行肺泡灌洗并測定ELF藥物濃度，結果表明萬古霉素在ELF的滲透率為41%。LAMER等[10]研究納入進行機械通氣重癥患者14例，測得的ELF滲透率為18%?？梢娭匕Y患者對藥物的體內過程，受疾病嚴重程度、器官功能狀態(tài)、白蛋白水平、合并癥等而千差萬別。此外，筆者對腎功能亢進患者與其他患者滲透率進行比較，結果差異無統(tǒng)計學意義，2例死亡患者與存活患者滲透率比較也差異無統(tǒng)計學意義，但由于本研究納入例數較少，此結果僅作為參考。

從本研究來看，萬古霉素肺組織滲透率低，在肺部感染患者，其ELF中藥物濃度可能不能滿足治療所需，制定治療方案的時候要根據萬古霉素的PK/PD特點，一是保證給予足夠的劑量，二是可以將給藥間隔由q12h調整為q8h甚至q6h。如果萬古霉素血藥濃度已達標但臨床效果未有改善時，尤其是當目標細菌MIC值較高的時候，應當考慮可能肺組織濃度不足所致，此時萬古霉素非最佳選擇。

由于涉及ICU患者以及特殊的采樣方式，本研究存在一些缺陷，如入組例數少，采樣時間受限，某些關鍵指標(器官功能、白蛋白水平、合并用藥等)基線不能充分匹配等。藥物對肺組織的滲透性與很多因素有關，其中比較重要的是血漿蛋白結合率，因為游離的藥物更加容易透過組織屏障，進入感染部位。萬古霉素為大分子，并非高蛋白結合率藥物，蛋白結合率約為50%，因此本研究設計中未考慮蛋白結合率變化的影響，所測定的血清、灌洗液藥物濃度均為總的藥物濃度(包括游離藥物和蛋白結合的藥物)。本研究對血清藥物及ELF藥物濃度進行分析，其隨時間變化趨勢具有一定的相關性，藥物在血液中PK過程與在ELF中PK過程類似。由于藥物蛋白結合率為濃度依賴性，因此藥物體內各部位的濃度也有很大差異，后續(xù)可以考慮蛋白結合率的影響，對藥物在血清、ELF中的PK特點進一步研究。

本研究納入16例患者，初步對萬古霉素在此類人群中的肺部滲透性進行研究，后期將收集更多患者，并細化入選標準，以獲得更具針對性的數據支持。