液質聯用法同時測定干血斑中環孢菌素A、西羅莫司、他克莫司和依維莫司藥物濃度

吳中豪 龔子珊 姜小梅 許舒欣 韓文念 李 艷 汪 曣*

(1.天津大學，精密儀器與光電子工程學院，天津 300399；2.中科院蘇州醫工所天津工程技術研究院，天津300399)

1 引言

免疫抑制劑是一類可抑制機體異常免疫反應的藥物，其在防治移植排斥、治療超敏反應引起的疾病和自身免疫性疾病中占據著十分重要的地位，臨床常用的免疫抑制類藥物有環孢菌素A、西羅莫司、他克莫司、依維莫司、霉酚酸酯、糖皮質激素等[1]。這類藥物的血藥濃度與免疫抑制程度和肝腎毒性密切相關，它們大多表現出較高的藥代動力學變異性，具有相對狹窄的治療窗口和暴露-反應關系[2-4]。因此在臨床應用時必須及時地監測其血藥濃度，在保證治療效果的同時應最大限度地減少排異反應及毒副作用[5]。目前該類藥物的檢測方法以LC-MS/MS法和免疫法(FPIA)為主，但是免疫分析法多以抗原抗體特異性結合為原理進行標記和篩選，在方法選擇性和特異性方面會有很大區別，有時還會發生嚴重的交叉反應[6]，而LC-MS/MS法由于其精密度、準確度及靈敏度方面的巨大優勢，是目前藥物檢測的金方法。

在器官移植術后的藥物治療中，多次采集全血增加了患者的生理負擔，也增加了門診患者的單次門診留院時間，而干血斑(Dried blood spots，DBS)采樣技術具有微創、成本低、樣本易于保存和運輸等優勢，非常適用于臨床血藥濃度檢測[7]。目前多數DBS方法僅用于一種或兩種免疫抑制劑的檢測，這限制了DBS方法在高通量檢測領域中的應用潛力。迄今為止，只有兩份報告記錄了LC-MS/MS方法在同時分析干血斑中4種免疫抑制劑方面的應用[8,9]。前者討論了紅細胞壓積和免疫抑制劑濃度對回收率的影響，并進行了詳細的方法學驗證，但與其它3種藥物的回收率相比(85.7%～98.8%)，所建方法使得環孢菌素A的提取受血藥濃度和紅細胞壓積影響較大，導致其在低濃度水平下的回收率異常高(121.3%)[8]。后者建立了穩定可行的免疫抑制劑檢測方法，但4種藥物的回收率較低(59.1%～80.0%)，具有更高提取回收率的新方法有待進一步探索[9]。

本實驗建立了一種同時定量檢測DBS中環孢菌素A、西羅莫司、他克莫司和依維莫司的高通量LC-MS/MS方法，并根據美國FDA發布的《生物分析方法驗證指南》[10]對方法的線性范圍、定量限、提取回收率、精密度與準確度、殘留效應和穩定性進行考察，根據歐洲EMA發布的《生物分析方法驗證指南》[11]對基質效應進行考察，以確保方法的可靠性，旨在為臨床免疫抑制劑的血藥濃度監測提供良好的參考方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

API 4000型三重四極桿質譜儀，美國AB Sciex公司；島津LC-20A液相色譜系統，日本島津公司；5427R型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；CE-7200A型超聲波清洗機，東莞潔康超聲波清洗機設備有限公司；VSD150-1A型氮吹儀，無錫沃信儀器制造有限公司；Milli-Q Advantage A10純水儀，德國Merck Millipore公司。

環孢菌素A、西羅莫司、他克莫司、依維莫司、子囊霉素(環孢菌素A與他克莫司的內標)、西羅莫司-d3(西羅莫司氘代內標)和依維莫司-d4(依維莫司氘代內標)均購自加拿大Toronto Research Chemicals公司；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，美國Fisher Scientific公司；鹽酸(分析純)，上海潤捷化學試劑有限公司；乙酸銨、七水硫酸鋅，美國Sigma-Aldrich公司；空白全血樣本(EDTA抗凝不含待測藥物的全血)來自健康志愿者；質控樣本為實驗室自制樣本；干血濾紙片為Whatman 903號濾紙(批號：10538018)，英國Whatman公司；實驗用水為超純水。

1.2 儲備液和工作液的制備

分別用甲醇溶解環孢菌素A、西羅莫司、他克莫司和依維莫司標準品，制備成100μg/mL的標準品儲備液(-20℃保存)；分別精密吸取一定量的標準品儲備液，混合后用甲醇依次稀釋，制備成含環孢菌素A濃度分別為400、800、1600、2000、3200、6400、16000、20000ng/mL，含西羅莫司、他克莫司和依維莫司濃度分別為40、80、160、200、320、640、1600、2000ng/mL的4藥混合系列標準品工作液，于4℃冰箱內保存備用。

分別用甲醇溶解子囊霉素、西羅莫司-d3和依維莫司-d4內標物，制備成100μg/mL的內標儲備液(-20℃保存)；分別精密吸取一定量的內標儲備液，混合后用甲醇稀釋，制備成含西羅莫司-d3濃度為350ng/mL，子囊霉素、依維莫司-d4濃度為100ng/mL的混合內標工作液，于4℃冰箱內保存備用。

1.3 標準曲線樣品和質控樣品的制備

精密吸取10μL標準品工作液分別添加到190μL空白全血中，渦旋混勻1min，室溫放置30min后，制得含環孢菌素A濃度分別為20、40、80、100、160、320、800、1000ng/mL，含西羅莫司、他克莫司和依維莫司濃度分別為2.0、4.0、8.0、10、16、32、80、100ng/mL的“全血標準曲線樣品”，室溫下放置，當天使用；同時制備定量下限、低、中、高4個濃度水平的“全血質控樣品”，其中環孢菌素A樣本濃度分別為20、40、320、800ng/mL，西羅莫司、他克莫司和依維莫司樣本濃度分別為2.0、4.0、32、80ng/mL，于4℃冰箱內保存。

精密吸取30μL全血樣品(全血標準曲線樣品、全血質控樣品)垂直滴于Whatman 903濾紙的采樣環中心，將濾紙轉移至試管架上，室溫過夜晾干后制得“DBS標準曲線樣品”和“DBS質控樣品”。其中，DBS標準曲線樣品中環孢菌素A濃度分別為20、40、80、100、160、320、800、1000ng/mL，西羅莫司、他克莫司和依維莫司濃度分別為2.0、4.0、8.0、10、16、32、80、100ng/mL。定量下限、低、中、高濃度的DBS質控樣品中環孢菌素A濃度分別為20、40、320、800ng/mL，西羅莫司、他克莫司和依維莫司濃度分別為2.0、4.0、32、80ng/mL。備用樣品干燥后裝入密封袋中，于-20℃冰箱內保存。

1.4 樣品前處理

于DBS中心位置打孔取樣直徑8mm的圓形血斑，置于微量離心管中，加入290μL甲醇-乙腈(80∶20，v/v)提取液、10μL混合內標工作液和20μL鹽酸溶液(0.05mol/L)。渦旋混勻后密封，50℃水浴下超聲提取并孵化30min[12]，隨后在預置好的4℃高速冷凍離心機內14000g/min離心10min，轉移上清液至自動進樣器微量試管中，室溫下氮氣吹干，底物用80μL甲醇溶液渦旋復溶3min，離心5min(14000g/min)，取上清液10μL進樣檢測。具體流程如圖1所示。

圖1 DBS樣品前處理方法流程圖

1.5 實驗方法

1.5.1色譜條件

Shim-pack GIST-HP型C18色譜柱(100mm × 2.1mm，3μm)，柱溫60℃，流速0.9mL/min，進樣量10μL，分析時間4.5min；流動相A為含有2mM乙酸銨和0.1%甲酸的水溶液，流動相B為含有2mM乙酸銨和0.1%甲酸的甲醇溶液；梯度洗脫：0～0.4min，40%B；0.4～2.2min，40%～100%B；2.2～3.0min，100%B；3.0～3.5min，100%～40%B；3.5～4.5min，40%B。

1.5.2質譜條件

采用電噴霧正離子電離(ESI+)和多反應監測(MRM)模式進行檢測，電噴霧電壓為4500V，離子源溫度為300℃，氣簾氣、霧化氣、輔助加熱氣壓力分別為25psi、70psi、55psi；去簇電壓為43～60V，碰撞室入口電壓為11V，碰撞能為23～29eV，碰撞室出口電壓為10～26V。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

實驗考察了甲醇-水、乙腈-水作為流動相時的影響，實驗發現，對于同等濃度的分析物，甲醇-水作為流動相時得到的色譜圖分離效果較好，其信號響應值和穩定性也較高。同時，在流動相中加入2mM的乙酸銨改善了分析物的峰形，加入0.1%甲酸提高了4種化合物的質譜響應值，降低了定量限。在此條件下，4種免疫抑制劑藥物在4.5min內便可有效分離(如圖2所示)。根據4種免疫抑制劑的親脂特性，選取C18柱，考察了流速、柱溫對分離效果和信號強度的影響，最終采用“1.5.1”的洗脫梯度，0.9mL/min的流速，以及60℃的柱溫分析條件。

2.2 質譜條件的優化

在MRM模式下，采用手動優化方法，依次對去簇電壓、碰撞室入口電壓、碰撞能量、碰撞室出口電壓、分析物及其內標的母離子和子離子等條件進行優化，最終確定的質譜分析條件如表1所示。

表1 4種免疫抑制劑及其內標的質譜分析條件

2.3 定量下限和標準曲線

使用已建立的LC-MS/MS分析方法測定3個濃度值接近檢出限的DBS樣品，每濃度進行6個樣本分析，連續測定3個批次，通過分析各濃度樣本測定結果的總變異系數(CV)和與理論值的偏差來確定方法的定量下限。根據2018年FDA發布的《生物分析方法驗證指南》[10]要求，CV值應≤ 20%，偏差應在±15%以內。結果顯示，環孢菌素A、西羅莫司、他克莫司和依維莫司的定量下限分別為20、2.0、2.0、2.0ng/mL，測定結果的偏差在-8.3%至8.6%之間，最大CV值為11.43%，方法滿足FDA的指南要求。此結果與Koster[8]等人所報道方法的定量下限(環孢菌素A、西羅莫司、他克莫司和依維莫司的定量下限分別為20、1.0、1.0、1.0ng/mL)相近，可完全覆蓋臨床用藥的低限濃度。4種免疫抑制劑的定量下限色譜圖及分子結構式如圖2所示。

圖2 4種免疫抑制劑定量下限色譜圖及分子結構式a.環孢菌素；b.西羅莫司；c.他克莫司；d.依維莫司

用所建方法測定“DBS標準曲線樣品”中4種免疫抑制劑的濃度(8個質量濃度梯度)，每一濃度進行雙樣本分析，記錄色譜圖。以各組分與其內標的峰面積比值(y)為縱坐標，各組分的濃度值(x)為橫坐標，用加權(w=1/X2)最小二乘法進行回歸計算。得到4種免疫抑制劑的線性范圍、標準曲線方程、相關系數及定量下限如表2所示。

表2 4種免疫抑制劑的線性范圍、標準曲線方程、相關系數和定量下限

2.4 提取回收率和基質效應

在對方法的提取回收率進行考察時，應準確知道打孔取樣的DBS樣品的負載血量，進而精確計算出空白對照樣中應加入的待測物和內標的用量。D.H. Vu[13]等人報道了用紅細胞壓積為32%～38%的全血制備的直徑8mm的血斑含血量約20μL。因此，本實驗采用剛好可以覆蓋8mm圓形濾紙片的20μL全血[14]來進行提取回收率和基質效應的驗證。

用20μL的低、中、高3個濃度水平的“全血質控樣品”制備DBS樣品，每濃度進行6個樣本分析，根據峰面積計算提取回收率。同時制備低、中、高3個濃度水平的純溶液樣品(溶劑為甲醇)，每濃度進行3個樣本分析，根據2011年EMA發布的《生物分析方法驗證指南》[11]進行基質效應驗證，通過計算4種免疫抑制劑在不同濃度水平下的內標歸一化基質效應因子[11]及其CV值來評價基質效應。提取回收率和基質效應結果見表3。實驗結果表明：方法具有較高的提取回收率，其中環孢菌素A為70.9%～76.4%；西羅莫司為81.7%～105.3%；他克莫司為105.4%～115.8%；依維莫司為89.1%～110.6%。本方法與Koster[8]等人的研究相比，可降低環孢菌素A藥物的濾紙片色譜效應，使其在不同濃度下的提取回收率水平相當；方法的回收率比den Burger[9]等人的研究(環孢菌素A，59.1～65.9%；西羅莫司，65.8%～64.1%；他克莫司，78.6%～80.0%；依維莫司，64.1%～64.2%)要高，可實現對DBS樣本中的4種免疫抑制劑進行更高效的提取。4種免疫抑制劑在低、中、高濃度水平下的內標歸一化基質效應因子的CV值均<15%，基質效應滿足EMA指南的相關規定[11]。

表3 4種免疫抑制劑的提取回收率和基質效應驗證結果

2.5 精密度與準確度

用所建方法檢測定量下限、低、中、高4個濃度水平的“DBS質控樣品”，每濃度進行5個樣本分析，連續測定3d。以當天的標準曲線計算DBS質控品濃度，以質控品測定結果來評估方法的精密度與準確度。結果如表4所示，4種免疫抑制劑的日內和日間精密度(CV)為1.9%～12.9%，準確度為-13.9%～8.6%。方法的精確度較高，結果滿足FDA指南的相關要求[10]。

表4 4種免疫抑制劑的精密度與準確度驗證結果

2.6 殘留效應

用所建方法連續測定低濃度的“DBS質控樣品”后，隨行交替測定高、低濃度的DBS質控品，通過比較低濃度質控樣品在第1次進樣和后續進樣的測定值來計算殘留效應[15]。結果顯示，環孢菌素A、西羅莫司、他克莫司和依維莫司的殘留率分別為8.1%、-0.7%、-2.8%、-2.6%，殘留效應均小于定量下限樣本濃度的20%。

2.7 穩定性

選用-20℃保存3個月的儲備液與新配儲備液制備低、高(環孢菌素A濃度為40、800ng/mL，西羅莫司、他克莫司和依維莫司濃度為4.0、80ng/mL)2個質控品濃度的儲備液樣本，每濃度進行5個樣本分析來考察儲備液穩定性；選用低、中、高3個濃度水平的“DBS質控樣品”，每濃度進行5個樣本分析。其中，前處理后樣品于20℃自動進樣器中放置1d后進行分析來考察自動進樣器穩定性，其余質控樣品裝入密封袋中，分別在不同溫度條件(25℃、4℃、-20℃)下保存不同時間(5d、14d、21d)后進行分析來考察DBS樣本穩定性。結果如表5所示，所有質控品濃度測定結果的準確度在-14.9%～14.2%之間，CV值均<14.2%，結果滿足FDA指南的相關規定[10]。表明儲備液于-20℃下至少可以穩定保存3個月，處理后樣品在自動進樣器內至少可以穩定保存1天，DBS樣品在室溫、4℃、-20℃條件下至少可以穩定保存5天、14天和21天。

表5 4種免疫抑制劑的穩定性驗證結果(n=5)

續表5

3 結論

本研究建立了一種高通量液相色譜-串聯質譜法同時定量檢測干血斑中環孢菌素A、西羅莫司、他克莫司、依維莫司的方法。通過對檢測條件的優化，實現了對免疫抑制劑的高效、精準分析。樣品前處理采用了甲醇-乙腈混合溶液提取和沉淀蛋白并結合氮氣吹干和甲醇復溶的方式，使方法獲得了較高的提取回收率(73.6%～110.8%)和較低的定量限。本方法具有快速、高效、準確度和精密度高、對病患友善、樣本采集、儲存和運輸方便等優點，為臨床免疫抑制劑的血藥濃度監測提供了良好參考方法。

值得注意的是，紅細胞壓積可通過影響血液的黏稠度進而影響滴加到采血濾紙片上的血液的擴散。因此，與高紅細胞壓積的血液相比，單位體積的低紅細胞壓積的血液獲得的干血斑會更大，這在打孔取樣時，可能會對固定面積的DBS樣品中的免疫抑制劑含量產生影響，進而造成分析誤差。此外，紅細胞壓積也會影響血液在濾紙片上的滲透性，可能使得藥物與濾紙片纖維之間的作用力發生變化，進而對方法的提取回收率造成影響。未來的研究可針對免疫抑制劑與濾紙片間的結合和提取機理進行深入探索，并考察和校正紅細胞壓積對本方法的影響。另外，本研究為滿足方法建立和驗證過程中需要大量樣本的要求，選擇了用移液槍吸取靜脈全血滴加于濾紙片上制成DBS樣本。日后的研究可采集真實病人樣本，包括靜脈全血、靜脈全血DBS、指尖血DBS，來進行方法考察，全面比較不同采集方式的樣本在該方法下所測得的免疫抑制劑藥物濃度差異，探討用指尖血DBS進行藥物濃度測定來代替目前常規的用靜脈全血進行藥物濃度測定的可行性，將本方法真正應用于臨床。