全自動(dòng)免疫磁珠凈化高效液相色譜法快速測(cè)定小麥中的嘔吐毒素

邵亮亮 杜京霖 盛林霞 應(yīng)美蓉 徐晨斌 章 程 李 燕

(1.浙江省糧油產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中心，杭州 310012； 2.浙江省糧食局直屬糧油儲(chǔ)備庫(kù)， 杭州 311100)

小麥?zhǔn)鞘澜缱钪匾墓任镔Y源之一，也是我國(guó)的主要糧食作物，其質(zhì)量安全關(guān)系到人們的身體健康和社會(huì)穩(wěn)定。真菌毒素特別是嘔吐毒素(Vomitoxin)是威脅我國(guó)小麥質(zhì)量安全的主要因素之一。嘔吐毒素也叫脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)，是一種單端孢霉烯族毒素[1]，主要來(lái)自鐮刀菌屬，具有細(xì)胞毒性、免疫抑制、致畸作用及可能的弱致癌性，人和動(dòng)物在誤食被該毒素污染的食物后會(huì)導(dǎo)致各類急性中毒癥狀[2-4]。歐盟法規(guī)規(guī)定，作為口糧的小麥，DON含量不得超過(guò)1250 μg/kg[5]，我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761-2017《食品中真菌毒素限量》規(guī)定了小麥、麥片和小麥粉中嘔吐毒素的限量均為1000 μg/kg[6]，超標(biāo)的小麥及其制品不能作為儲(chǔ)備糧也不能進(jìn)入市場(chǎng)[7]。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于嘔吐毒素檢測(cè)的方法主要有薄層色譜法[8]、酶聯(lián)免疫吸附法[9]、膠體金免疫層析法[10]、高效液相色譜法[11]、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[12，13]等。其中薄層色譜法由于溶劑消耗量大、重現(xiàn)性差等原因目前很少使用，酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金免疫層析法和真菌毒素快速檢測(cè)儀法一般用于快速檢測(cè)和大批量樣品的初篩，容易出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果，不能作為準(zhǔn)確定量法使用，而高效液相色譜法和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法能夠精確定量，但前處理過(guò)程均需要采用免疫親和柱凈化、氮吹等前處理，過(guò)程繁瑣、耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)。近年來(lái)，免疫磁珠富集凈化法由于具有操作簡(jiǎn)便、分離快速和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，逐漸應(yīng)用于真菌毒素檢測(cè)[14-17]，但目前尚未制定嘔吐毒素免疫磁珠凈化的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。本研究采用的真菌毒素全自動(dòng)免疫磁珠凈化儀采用免疫磁珠富集凈化技術(shù)，嘔吐毒素經(jīng)提取后，特異性地吸附在磁珠表面的抗體上，通過(guò)內(nèi)置磁棒完成全自動(dòng)高通量的磁吸、轉(zhuǎn)移、洗滌和洗脫的全過(guò)程，搭配超高效液相色譜儀，完成樣品中嘔吐毒素的快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)。本方法簡(jiǎn)化了前處理過(guò)程，提高了檢測(cè)的自動(dòng)化水平和檢測(cè)效率，可以滿足大批量樣品的DON快速定量檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Agilent1260型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent 公司)；JJHZ10型真菌毒素全自動(dòng)凈化儀(北京東孚久恒儀器技術(shù)有限公司)；LM3100型錘式實(shí)驗(yàn)室粉碎磨(瑞典Perten公司)；PL202-L型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)； EOAA-HM-01型多管漩渦混合器(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；3-18K型離心機(jī)(德國(guó)Sigma 公司)；4204型電動(dòng)分樣器(美國(guó)Gamet公司)。

1.2 材料與試劑

嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液(CAS：51481-10-8，濃度為199 mg/L，不確定度為±10 mg/L，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；嘔吐毒素凈化試劑盒(北京東孚久恒儀器技術(shù)有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司)；聚乙二醇(分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；小麥樣品，由浙江省內(nèi)小麥種植農(nóng)戶提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣品前處理

樣品制備參考《糧食中真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)、法規(guī)和檢驗(yàn)》中的樣品制備方法[18]，前處理方法參考國(guó)標(biāo)GB 5009.111-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測(cè)定》第二法免疫親和層析凈化高效液相色譜法[19]，并結(jié)合嘔吐毒素凈化試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行：小麥樣品通過(guò)實(shí)驗(yàn)室粉碎磨進(jìn)行粉碎，過(guò)20目曬網(wǎng)，準(zhǔn)確稱取5 g(精確到0.01 g)固體粉末樣品于50 mL離心管中，加入1.0 g聚乙二醇和20 mL去離子水，渦旋振蕩提取20 min，然后離心機(jī)6000 r/min離心5 min。用1 mL移液槍準(zhǔn)確移取提取上清液1.0 mL加入試劑盒的1號(hào)樣品孔中，將試劑盒放入真菌毒素全自動(dòng)凈化儀，按照設(shè)定的嘔吐毒素凈化程序開(kāi)始凈化。凈化結(jié)束，用1 mL移液槍準(zhǔn)確吸取0.5 mL去離子水至5號(hào)樣品孔中，混合均勻后使用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，收集濾液于進(jìn)樣瓶中供高效液相色譜測(cè)定。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用移液管準(zhǔn)確吸取0.5 mL嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成濃度為10.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確移取0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用70 %的甲醇水溶液定容至刻度，得到0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃保存。

1.3.3儀器條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A相水+B相甲醇+C相乙腈(80+5+15)；柱溫35 ℃ ；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量50 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：218 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 試樣前處理?xiàng)l件的選擇與優(yōu)化

由于小麥試樣感染嘔吐毒素并不均勻，不同籽粒、不同的部位所含嘔吐毒素差異較大[20],為了保證試樣的代表性和檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要大量取樣以制備樣品[21]，本實(shí)驗(yàn)將小麥樣品混合均勻，通過(guò)分樣器縮分至1 kg左右再通過(guò)實(shí)驗(yàn)室粉碎磨粉碎，混勻。試樣稱樣量為5 g，便于在離心管中渦旋振蕩提取，但同國(guó)標(biāo)5009.111-2016相比稱樣量縮小了5倍。此外，國(guó)標(biāo)法中洗脫液需先通過(guò)氮吹儀氮吹至近干，再用流動(dòng)相定容至1.0 mL，而本實(shí)驗(yàn)為了快速測(cè)定，無(wú)需通過(guò)氮吹，改為在洗脫液(1.0 mL)中加入0.5 mL純水，定容至1.5 mL。為了驗(yàn)證本方法的可行性，本實(shí)驗(yàn)選擇了一個(gè)嘔吐毒素含量為1163 μg/kg的小麥陽(yáng)性樣品，分別采用兩種前處理方法(A：稱樣量5 g，渦旋提取，不氮吹，定容至1.5 mL；B：稱樣量25 g，振蕩提取，氮吹，定容至1.0 mL)進(jìn)行6次提取，比較結(jié)果的差異性，見(jiàn)表1。通過(guò)T檢驗(yàn)可知，A法和B法測(cè)定結(jié)果之間沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)結(jié)論與文獻(xiàn)一致[22]。

表1 兩種DON測(cè)定前處理方法的結(jié)果比較

2.2 全自動(dòng)免疫磁珠凈化儀參數(shù)優(yōu)化

由于小麥樣品基質(zhì)較復(fù)雜，待測(cè)液如果直接進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定會(huì)產(chǎn)生很多干擾峰，影響檢測(cè)結(jié)果，因此進(jìn)樣前需要對(duì)待測(cè)液進(jìn)行凈化處理，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)全自動(dòng)免疫磁珠凈化儀進(jìn)行凈化。全自動(dòng)免疫磁珠凈化儀凈化過(guò)程見(jiàn)圖1。凈化過(guò)程就是磁棒帶動(dòng)磁珠在試劑盒各孔位之間的富集、清洗和洗脫等操作步驟。其中試劑盒1號(hào)孔位為樣品上樣和稀釋孔，2號(hào)孔位為免疫磁珠孔，含磷酸鹽緩沖液(PBS)，3、4號(hào)孔位為清洗孔，含Twen-20的磷酸鹽緩沖液(PBST), 5號(hào)孔位為洗脫孔，洗脫液為甲醇。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的全自動(dòng)免疫磁珠凈化儀參數(shù)見(jiàn)表2。在此參數(shù)下，30min內(nèi)能同時(shí)完成10個(gè)樣品的凈化。樣品凈化后，通過(guò)高效液相色譜測(cè)定可以有效去除提取液中的干擾物質(zhì)，得到理想的色譜圖(圖2)。

圖1 全自動(dòng)免疫磁珠凈化儀凈化過(guò)程

表2 全自動(dòng)免疫磁珠凈化儀參數(shù)

2.3 液相色譜條件的選擇和優(yōu)化

通過(guò)紫外掃描，可知DON最大吸收波長(zhǎng)在218 nm附近，故選擇218 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，此外通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器(DAD)可以對(duì)樣品目標(biāo)峰進(jìn)行光譜分析，減少假陽(yáng)性結(jié)果，因此本實(shí)驗(yàn)選擇DAD檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。

由于本方法不需通過(guò)氮吹，定溶液甲醇含量較高，而常用的流動(dòng)相中有機(jī)相比例較低，液相分析時(shí)容易產(chǎn)生不同程度的溶劑效應(yīng)，從而影響DON峰型，因此需要對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)采用3種流動(dòng)相進(jìn)行比較：A.水+甲醇=20+80，B.水+乙腈=20+80，C.水+甲醇+乙腈+20+5+15，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相為A時(shí)，溶劑效應(yīng)影響很大，目標(biāo)峰峰形很差，影響結(jié)果準(zhǔn)確性；流動(dòng)相為B時(shí)，無(wú)溶劑效應(yīng)，目標(biāo)峰峰形良好，但出峰提前，與溶劑峰和雜峰分離度較差；流動(dòng)相為C時(shí)，無(wú)溶劑效應(yīng)，目標(biāo)峰良好，且與溶劑峰和雜峰等具有很好的分離度，DON在6min可完成分析，符合DON快速測(cè)定的要求。DON標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)和樣品(B)的液相色譜圖如圖2所示。

圖2 DON標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)和樣品(B)的高效液相色譜圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢出限

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)6個(gè)不同質(zhì)量濃度(0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 μg/mL)的DON標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以DON目標(biāo)峰的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖3，并根據(jù)信噪比(S/N)確定檢出限(LODs，RSN=3)和定量限(LOQs，RSN=3)。如圖所示，DON在線性范圍內(nèi)具有很好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=58.62X-0.34，相關(guān)系數(shù)為0.9999，檢出限為40.9 μg/kg，定量限為136.4 μg/kg。

2.5 方法準(zhǔn)確性

對(duì)23個(gè)具有不同DON污染水平的小麥樣品，分別采用免疫親和柱凈化法(國(guó)標(biāo)法)和全自動(dòng)免疫磁珠凈化法(儀器法)進(jìn)行前處理，并測(cè)定DON含量(CDON)，比較結(jié)果的差異性和一致性。將樣品分為輕度污染組(CDON≤1000 μg/kg)、中度污染組(1000 μg/kg2500 μg/kg)分別比較，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 儀器法與國(guó)標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較

圖3 DON標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過(guò)SPSS配對(duì)T檢驗(yàn)可知，DON輕度或中度污染的小麥樣品(CDON≤2500 μg/kg)，采用國(guó)標(biāo)法和儀器法進(jìn)行前處理，DON測(cè)定結(jié)果沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，通過(guò)Kendall一致性檢驗(yàn)可知，DON輕度或中度污染的小麥樣品采用兩種凈化法進(jìn)行前處理，DON測(cè)定結(jié)果具有顯著的一致性(Kendall漸進(jìn)顯著性P<0.05)，且一致性水平很高(K(W)≥0.98)；然而當(dāng)小麥DON污染水平較高時(shí)(CDON>2500 μg/kg)，通過(guò)儀器法進(jìn)行前處理測(cè)得的DON結(jié)果比國(guó)標(biāo)法顯著偏低(P<0.05)，兩者結(jié)果不具有一致性(Kendall漸進(jìn)顯著性P>0.05)。出現(xiàn)偏差的原因是全自動(dòng)免疫磁珠凈化法測(cè)定DON污染水平較高的小麥樣品時(shí)，樣品提取液中的DON含量超過(guò)了免疫磁珠抗體的最大吸附量而出現(xiàn)吸附不完全，從而造成DON測(cè)定結(jié)果偏低。因此，對(duì)于重度污染的樣品，提取時(shí)需要適當(dāng)稀釋，使DON含量在免疫磁珠最大吸附量范圍內(nèi)，即可保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.6 回收率和精密度

向不含DON的小麥全麥粉中添加低、中、高3個(gè)濃度水平的DON標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照全自動(dòng)免疫磁珠凈化儀設(shè)定的方法進(jìn)行凈化，并通過(guò)HPLC測(cè)定DON含量，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6次，計(jì)算3個(gè)濃度水平下DON的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表4所示。在3個(gè)濃度水平下DON平均回收率在94.96～108.58 %范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5.0 %，說(shuō)明該方法可靠，精密度良好，符合高效液相色譜法快速測(cè)定的要求。

表4 DON加標(biāo)回收率(n=6)

2.7實(shí)際樣品測(cè)定

采用1組10孔的嘔吐毒素凈化試劑盒，可以同時(shí)對(duì)10個(gè)小麥樣品進(jìn)行全自動(dòng)免疫磁珠凈化操作，本實(shí)驗(yàn)選擇本地生產(chǎn)的10個(gè)不同品種的小麥樣品，進(jìn)行3次平行測(cè)定，結(jié)果如表5所示。10個(gè)小麥樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10 %，符合國(guó)標(biāo)GB 5009.111-2016第二法規(guī)定的精密度要求(<23 %)。受種植環(huán)境的影響，本實(shí)驗(yàn)選擇的10個(gè)不同品種小麥中均檢出DON，且含量有較大差異，其中鎮(zhèn)麥12和鎮(zhèn)麥168的DON含量超過(guò)國(guó)標(biāo)限量(1000 μg/kg)，而蘇麥188和揚(yáng)麥23的DON含量較低。

表5 不同品種小麥中DON含量

續(xù)表5

3 結(jié)論

采用全自動(dòng)免疫磁珠凈化法對(duì)小麥樣品進(jìn)行凈化處理，通過(guò)高效液相色譜快速測(cè)定DON含量。小麥樣品前處理中通過(guò)全自動(dòng)免疫磁珠凈化儀進(jìn)行批量?jī)艋?jié)省大量的人力和時(shí)間，樣品無(wú)需通過(guò)氮吹，可以直接通過(guò)條件優(yōu)化后的高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，在6 min內(nèi)就能進(jìn)行準(zhǔn)確定量。該方法快速、準(zhǔn)確，回收率和精密度高，并能達(dá)到良好的分離效果，適用于實(shí)驗(yàn)室對(duì)批量小麥中DON的快速測(cè)定。