基于BATMAN-TCM在線分析平臺的浙貝母-瓜蔞配伍治療慢性阻塞性肺病的網絡藥理學研究

曹銘晨，徐龍，辛兆洋，方孟香，邢曉敏，陳蕭，汪川，魏欣欣，任煒*

(1.青島大學附屬醫院，山東 青島 266000；2.西海岸新區第二中醫院，山東 青島 266400)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種進行性的以不可逆氣流受限為特點的慢性炎癥性疾病，其高患病率和病死率成為目前世界范圍內重要的公共衛生問題之一[1-3]。COPD本質是復雜的慢性炎性過程，包括氣道中性粒細胞炎癥、氧化應激、肺間質T細胞浸潤和反復感染等[1]。目前COPD治療中常用支氣管舒張劑、糖皮質激素等，短期內可有效緩解癥狀并減少急性加重次數，但長期用藥引發的副作用如耐藥性、多重感染、消化道潰瘍、免疫力低下、骨質疏松等問題不容忽視[2]。中醫對COPD的治療具有豐富的經驗，認為此病屬“喘證”“肺脹”“痰飲”范疇，是由于肺、脾、腎功能失調導致津液代謝失常、水液停聚于肺部而形成的一種病變，臨床以咳嗽、咳痰、喘息等為主要癥狀[3]。浙貝母-瓜蔞(Fritillariae Thunbergii Bulbus-Trichosanthis Fructus, FTB-TF)配伍是治療肺部疾病常用的藥對，浙貝母主入肺經，具清熱化痰散結、潤肺止咳之功，瓜蔞甘寒而潤，善祛痰散結、清熱滌痰、利氣潤燥，與浙貝母相須為用，增強清潤化痰而止咳，但是這一藥對在COPD治療中的分子機制仍不明確。

中藥復方具有多成分-多靶點-多通路協同作用的特點,網絡藥理學以系統生物學為基礎，整合藥物、生物學數據庫，應用生物信息學手段構建藥物-基因-靶點-疾病的網絡模型，從生物網絡的系統水平預測分析中藥復方的可能作用機制，與中醫藥整體觀念、組方配伍及中藥多成分-多靶點調控的特點不謀而合[4]。本文基于中藥分子機理的生物信息學分析工具(bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，BATMAN-TCM)在線分析平臺，應用網絡藥理學的方法探索浙貝母-瓜蔞配伍在COPD治療中的分子作用機制。

1 研究工具

基于BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)[5]獲取浙貝母-瓜蔞的主要成分信息并預測可能的相互關系靶點的基因信息；基于中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)[6]獲取浙貝母-瓜蔞主要成分的藥動學參數；應用GeneCards數據庫檢索并篩選COPD的靶點；應用Cytoscape 3.7.1軟件[7]構建化合物-疾病-靶點相互作用網絡；基于DAVID(the database for annotation,visualization and integrated discovery)[8]、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)[9]、STRING數據庫[10]、R語言包3.5.1[11]進行通路富集分析。

2 研究方法與結果

2.1 基于BATMAN-TCM預測浙貝母-瓜蔞治療COPD的潛在靶點

BATMAN-TCM是一款中藥成分分子機制的生物信息學分析工具，其預測模型基于化學結構(包括基于FP2指紋圖譜和基于官能團的相似度評分)，副作用，解剖、治療和化學(anatomical, therapeutic and chemical, ATC)分類系統，藥物誘導相似性來衡量藥物-相似性基因表達和化學-化學關聯的數據挖掘評分；基于蛋白質序列、蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡中的緊密度和基因本體(gene ontology，GO)功能注釋評分來預測蛋白質-蛋白質相似性；選擇最小冗余最大相關性(mRMR)特征之后，最終集成ATC-GO, FP2-closeness, STITCH-sequence, expression-closeness, ATC-sequence, functional_group-sequence, functional_group-GO 和side_effect-sequence 8個特征參數，采用最大似然比檢驗(likelihood ratio test,LR)用作最終預測分數，根據預測得分遞減的順序對所有候選蛋白質排名，評分較高的蛋白質視為潛在藥物靶標，預測模型預測性能可信度較高[1]。

預測相關參數設置如下：

(1)選擇輸入類型：中草藥或中草藥清單；

(2)中草藥或中草藥清單(拼音/拉丁語/英文名，每行一種)：瓜蔞和浙貝母；

(3)輸入預測分數的最低限度：20；

(4)Benjamini-Hochberg多元檢測校正后的P值(調整后的P值)：0.05。

預測得到浙貝母-瓜蔞各活性成分相關的target name、gene、fit score等參數，篩選得到BATMAN-TCM相似度評分大于50的關鍵靶點共418個，涉及活性化合物31個。

GeneCards是一個整合了125個包括基因組、轉錄組學和蛋白質組學等基因數據庫的綜合性可檢索數據庫，分別以關鍵字“chronic obstructive pulmonary diseases”“COPD”篩選COPD相關的靶點基因信息，剔除相同靶點后得到疾病關鍵靶點1878個，應用R語言軟件制作疾病-藥物靶點的VENN圖(圖1)，VENN圖顯示浙貝母-瓜蔞涉及205個靶點與COPD相關，占關鍵靶點數的49.5%，提示浙貝母-瓜蔞在COPD的治療中可能存在一定的應用價值。浙貝母-瓜蔞的成分中涉及靶點的活性化合物21個，檢索TCMSP數據庫并列出相關化合物的藥物學參數(表1)。

圖1 浙貝母-瓜蔞和COPD的靶點基因VENN圖

表1 浙貝母-瓜蔞活性成分及其藥動學參數

2.2 構建浙貝母-瓜蔞治療COPD的化合物-靶點網絡

將2.1節篩選的浙貝母-瓜蔞活性成分及相關靶點信息導入Cytoscape軟件，構建化合物-疾病-靶點網絡。其中節點(node)代表化合物、基因、蛋白質等靶點，節點與節點之間的連接(edge)代表相互作用，構建的化合物-疾病-靶點網絡(圖2)共包含435個節點，其中組蛋白脫乙酰基酶2(histone deacetylase 2, HDAC2)、重組人乙醇脫氫酶1C(recombinant human alcohol dehydrogenase 1C, ADH1C)、核糖核酸酶(ribonuclease, RNASE)、鉀電壓門控通道亞家族D成員3(potassium voltage-gated channel subfamily D member 3, KCND3)、鈉通道蛋白9型亞基(sodium channel protein type 9 subunit alpha, SCN9A)等靶點能與大于等于10個化合物發生相互作用，證明浙貝母-瓜蔞多成分-多靶點共同作用的特點。

圖2 浙貝母-瓜蔞的化合物-疾病-靶點網絡

2.3 構建浙貝母-瓜蔞關鍵靶點的蛋白相互作用網絡

STRING數據庫基于目前已知和預測的蛋白質之間直接、間接相互作用信息，通過計算得到每個蛋白相互作用程度的P值，P值高則蛋白質相互作用的置信度高。上傳浙貝母-瓜蔞與COPD的共同關鍵靶點至STRING在線數據庫，獲取蛋白相互作用信息，選取P>0.9的最高置信度的蛋白關系，構建浙貝母-瓜蔞治療COPD的相關靶點蛋白在系統水平上的PPI網絡(圖3)。PPI網絡包含131個節點和236條相互作用關系(連線)。根據網絡拓撲學性質分析結果，其中介數和度值大于均值(介數為0.54，度值為3.6)的關鍵節點，包括膜聯蛋白A1(annexin-A1, ANXA1)、組蛋白脫乙酰基酶1(histone deacetylase 1, HDAC1)、HDAC2、內皮素1(endothelin 1, EDN1)、類視黃醇X受體(retinoid X receptor alpha,RXRA)、Alpha-2腎上腺素能受體(alpha-2A adrenergic receptor, ADRA2A)、催產素(oxytocin, OXT)等，其中RXRA能與12個蛋白發生相互作用。

圖3 浙貝母-瓜蔞治療COPD的相關靶點PPI網絡

2.4 GO富集分析

基于DAVID v6.8數據庫，采用改進的Fisher精確檢驗算法對PPI網絡中的蛋白進行基因本體GO富集分析，探索浙貝母-瓜蔞的靶點蛋白在基因功能中的作用，應用R軟件繪制GO富集分析結果條形圖。根據P值(P<0.005)列出前20條GO途徑(圖4)，分析結果提示浙貝母-瓜蔞相關條目主要涉及離子門控通道活性、門控通道活性、底物特異性通道活性、通道活性、被動跨膜轉運活性、離子通道活性、陽離子通道活性、細胞外配體門控離子通道活性、神經遞質受體活性、配體門控離子通道活性等。

圖4 GO通路富集分析條形圖

2.4 KEGG 通路富集分析

應用DAVID v6.8數據庫對PPI網絡中的蛋白進行KEGG生物通路富集分析，探索浙貝母-瓜蔞活性成分的靶點蛋白在信號通路中的作用，相關靶點基因列表導入DAVID數據庫，勾選OFFICIAL_GENE_SYMBOL、Gene list、Submit list，選擇基因功能分類工具，修改背景為人類，選擇Pathway，篩選P<0.01的通路確定為可靠通路，結合KEGG數據庫進行通路注釋和分析。利用R語言對主要代謝通路、生物過程進行繪圖分析。KEGG通道分析主要涉及神經活動配體-受體相互作用、cAMP信號通路、鈣離子信使通路、類膽堿能突觸、逆行內源性大麻素信號傳導、5-羥色胺能突觸、多巴胺能突觸、尼古丁成癮、催產素信號通路、安非他命成癮、GABA能突觸等途徑，通路富集基因ID見表2，根據P值(P<0.05)列出前20條通路(圖5)。

圖5 KEGG通路富集分析點狀圖

表2 KEGG通路富集分析靶點基因ID

3 討論

浙貝母-瓜蔞的關鍵靶點如ANXA1、HDAC與COPD進展密切相關。ANXA1是一類鈣依賴磷脂結合蛋白，與糖皮質激素調節以及作為應激蛋白參與細胞增殖、分化及凋亡等有關，ANXA1在COPD合并肺部細菌感染中高表達，且存在病原菌種類和藥物敏差異特點[12]。而HDAC是調節COPD患者炎癥因子、氧化應激、糖皮質激素抵抗的主要蛋白之一，參與調控COPD患者的肺泡上皮細胞衰老和慢性炎癥進程[13-16]，HDAC2蛋白失活，誘導IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α等炎癥因子表達[13]。COPD患者肺組織中HDAC2、HDAC5、HDAC8的mRNA水平顯著降低，而重度COPD患者的HDAC2蛋白水平顯著降低，HDAC2表達與COPD的氣道高反應性具有較高相關度[14]，且與COPD患者肺組織中氧化應激和硝化應激的發生有關[15-16]。因此，HDAC失衡在COPD的炎癥進展中非常關鍵，浙貝母-瓜蔞是否通過恢復HDACs活性，使其發生去乙酰化阻斷炎癥基因轉錄、抗氧化應激及減輕糖皮質激素抵抗，從而控制COPD發展值得進一步深入研究。

分析顯示浙貝母-瓜蔞的分子途徑主要涉及離子門控通道活性、底物特異性通道活性、被動跨膜轉運活性、離子通道活性、細胞外配體門控離子通道活性、神經遞質受體活性等，推測可能通過影響不同類型通道活性而產生相應藥理作用。而KEGG富集分析中相關度最高的途徑為神經活動配體-受體相互作用，其中包括類膽堿能、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)、多巴胺等神經遞質可能在浙貝母-瓜蔞調控COPD中發揮重要作用，即浙貝母-瓜蔞可能通過調控某些通道的活性，影響類膽堿能、5-羥色胺、多巴胺等多種神經活動配體-受體的相互作用而實現多靶點調控COPD的進展，證明了中藥復方多成分-多靶點的作用特點。多巴胺是一種中樞神經遞質，具有調節神經、內分泌等多種生理功能，還可能存在抗炎作用[17]，研究顯示多巴胺受體激動劑可用于治療COPD的咳嗽和咳痰等癥狀[18]；在COPD合并心力衰竭治療中，多巴胺可選擇性興奮心臟β-受體，改善膈肌、腦和冠狀動脈供血[19]。COPD患者呼吸道阻塞最重要的可逆機制是膽堿能引起呼吸道收縮，肺部膽堿能神經分布于血管、腺體、支氣管平滑肌和呼吸性細支氣管。膽堿能受體分為M受體和N受體，肺組織中主要存在M1、M2、M3等3種M受體亞型。COPD患者呼吸道和肺組織中M受體的數量或功能異常，M受體數量減少，M2受體比例降低，M1、M3受體比例增加[20]。5-HT與呼吸系統疾病密切關聯，生理狀態下5-HT主要儲藏于血小板致密體中，當血小板受到炎癥、低氧等因素刺激釋放大量5-HT并與轉運體結合，引起肺血管收縮及血管平滑肌細胞增殖等病理反應[21]，COPD狀態下5-HT轉運體基因表達明顯增高，5-HT大量釋放進一步促進COPD加重[22]。此外，KEGG富集分析提示浙貝母-瓜蔞可能同時影響多巴胺和Ca2+信使通路，提示其在COPD心肺功能不全治療上可能具有一定價值。現代臨床治療COPD心肺功能不全多應用硝苯地平和多巴胺，硝苯地平是一種較強的Ca2+通道阻滯劑，通過抑制Ca2+內流促進擴張冠狀動脈和增加血流量、松弛血管平滑肌，降低舒張期細胞內Ca2+超負荷而增強心肌舒縮活動協調性，改善主動脈舒縮功能，降低心率，改善患者氣道通氣功能[23-25]。因此，浙貝母-瓜蔞是否同時作用于兩條通路而改善COPD心肺功能不全仍值得進一步探索。

綜上所述，本文基于網絡藥理學的方法從分子作用機制方面深入挖掘了浙貝母-瓜蔞配伍治療COPD可能的作用靶點和信號通路，揭示了浙貝母-瓜蔞多成分-多靶點-多通路調控COPD進展的作用特點。我們發現浙貝母-瓜蔞與COPD靶點相關的活性化合物包括較多揮發油類成分及其常含有的小分子醇、醛及酸類化合等，推測浙貝母-瓜蔞的揮發油部分可能是治療COPD的關鍵活性部位。COPD存在不同程度的肺氣阻塞、通氣障礙，根據中醫學“滯則通之”的治療原則可以應用具有芳香行氣、理氣通關、化濕醒脾等藥理作用的芳香類中藥，而揮發油成分是芳香中藥的主要藥理活性部位，浙貝母、瓜蔞雖不屬于芳香類藥物，但揮發油部位可能具有相似的藥理作用。目前關于浙貝母-瓜蔞配伍前后揮發油部位化學成分及藥理活性的研究較少，值得深入研究。此外，分子對接及PPI網絡提示的關鍵靶點如ANXA1、HDAC2，其中ANXA1是Campesterol(浙貝母/瓜蔞)、Bryonolic Acid(瓜蔞)、Cucurbitacin C(瓜蔞)3種化合物的共同靶點，而HDAC2是Palmitone(浙貝母/瓜蔞)、N-Nonanol(瓜蔞)、Lauric Aldehyde(瓜蔞)3種化合物的共同靶點，提示該藥對協同治療COPD的作用特點，且以瓜蔞的活性成分為主，這與中藥理論中瓜蔞作為君藥以“開胸散結”的功效治療COPD的理念不謀而合，后續可以從兩者配伍后關鍵靶點的表達變化情況及相關活性成分的篩選方面開展進一步研究。生物通路方面主要涉及類膽堿能、5-羥色胺、多巴胺等多種神經活動配體-受體的相互作用等，也為深入研究浙貝母-瓜蔞的整體性作用機制提供參考和新的研究方向。