抗氧化劑改善卵巢功能的研究進展

覃穎

卵巢功能減退(premature ovarian insufficiency,POI)和卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)所導致的生育力下降以及由于雌激素缺乏所引發的圍絕經期癥狀嚴重影響了患者的身體、心理健康[1]。隨著現代社會女性結婚生育年齡的推后，如何改善高齡女性的卵巢功能以提高受孕成功率成為目前備受關注的難點問題。研究發現卵巢早衰與自身免疫紊亂有關，但是卵巢功能減退并非是絕對不可逆的過程，通過免疫治療等干預手段有望改善卵巢功能[2]。此外，放療及化療雖然提高了女性癌癥患者的生存率，但也嚴重損傷卵巢組織加速卵巢功能衰竭。目前提出在女性癌癥患者接受放化療之前將她們的卵子、胚胎或卵巢組織進行冷凍保存，待化療結束后再移植回患者體內以避免放化療對卵巢損傷的治療方案[3]。這一方案雖具有一定的可行性，但也存在局限性。首先胚胎冷凍不適用于未婚女性。其次無論是卵子或是胚胎的冷凍，都必須經歷一定時間的促排卵，這勢必會耽誤某些重癥癌癥患者的有效治療時機。卵巢組織冷凍保存可以彌補胚胎及卵子保存的局限性，但是目前卵巢移植的成功率較低且存在移植回體內后導致癌癥復發的風險，而在卵巢組織體外培養方面仍存在較大的技術瓶頸，因此限制了此方案的應用。

因此，需要探索更多有效安全可行的方案去改善女性患者的卵巢功能及生育能力。氧化應激(oxidative stress,OS)加速人體內各臟器細胞的老化和凋亡，大量的研究表明卵巢功能的衰竭與氧化應激有關，尤其在女性隨著年齡增長所伴隨的卵巢功能減低過程中，氧化應激是其中不可忽視的重要因素。醫源性因素(放化療等)以及生活習慣和環境因素導致的氧化應激也有可能損傷卵巢功能及生育能力[4]。此外,多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)所伴隨的胰島素抵抗及糖脂代謝異常也能誘發機體及卵巢內的氧化應激損傷，從而影響卵泡發育及排卵[5]。因此應用有效的抗氧化劑有望改善由于高齡、放化療、多囊卵巢綜合征及各種環境因素所導致的卵巢功能損傷。以下我們將詳細闡述氧化應激如何誘發卵巢衰竭，以及幾種常見抗氧化劑的作用機理和研究進展。

一、氧化應激誘發卵巢功能衰竭

1.氧化應激的產生：在機體和細胞的生理代謝過程中會產生活性氧(reactive oxygen species,ROS),ROS主要包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(OH-)和過氧化氫(H202)。同時，機體和細胞內部也存在內源性抗氧化體系，它們主要包括作為活性氧清除劑的谷胱甘肽(glutathione，GSH)，以及抗氧化物酶類的錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，MnSOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)和谷胱甘肽巰基轉移酶(glutathione-S-transferase，GST)等。在正常狀態下，足量的內源性抗氧化體系能清除大部分的ROS，即細胞內的ROS與內源性的抗氧化體系成動態平衡[4]。但是在異常狀態下，比如高齡所導致的機體和細胞內過量的ROS產生和GSH、MnSOD等抗氧化酶的缺失，或者由于放化療過程中或是長期高脂飲食導致體內過量的ROS產生，都會打破ROS與抗氧化體系之間的平衡，導致過量的無法清除的ROS囤積在細胞內，形成有害的氧化應激狀態。

2.氧化應激加速卵巢功能衰竭：細胞內低濃度的ROS可以刺激細胞生長，而遠大于內源性抗氧化體系清除能力的ROS會導致高濃度的ROS囤積在細胞內，演變為有害的氧化應激，損傷細胞并加速細胞老化及凋亡[4,6]。氧化應激會損傷線粒體DNA，導致線粒體功能紊亂，使線粒體攝取Ca2+增加，高濃度的Ca2+會抑制線粒體合成ATP，ATP的缺乏影響細胞生長甚至導致凋亡。此外，氧化應激導致線粒體內的細胞色素C釋放到細胞漿，進而激活了caspase-3所誘發的細胞凋亡[6-7]。

從青春期開始的第一次減數分裂再啟動促使始基卵泡陸續募集發育為初級卵泡進而進入接下來的生長階段，我們將次級卵泡及小的竇狀卵泡統稱為生長階段卵泡，之后優勢卵泡排卵完成第一次減數分裂，成功受精后完成第二次減數分裂。在正常生理狀態下，ROS與內源性抗氧化體系處于動態平衡,當始基卵泡發育到生長階段卵泡后，生長階段卵泡內的顆粒細胞會分泌大量的始基卵泡活化抑制因子，從而抑制始基卵泡的募集，從而使卵巢卵泡池內的始基卵泡數量維持在正常范圍。然而，各種因素所誘發的氧化應激會損傷卵巢內的卵母細胞、顆粒細胞和間質細胞，其中顆粒細胞對氧化應激損傷最為敏感，同時處于減數分裂活躍狀態的卵母細胞比處于休止狀態的卵母細胞更容易遭受氧化應激損傷[8]。因此，富含顆粒細胞且處于活躍狀態的生長階段卵泡受氧化應激損傷最嚴重最易發生凋亡，損傷凋亡使其分泌的始基卵泡活化抑制因子顯著減少，促進了始基卵泡的募集，從而間接誘導了始基卵泡儲備量的丟失。此外，在高強度氧化應激狀態下，也可以直接刺激一些耐受力弱的始基卵泡凋亡。因此，氧化應激間接或是直接地加速了始基卵泡儲備的丟失，誘發卵巢功能衰竭。

二、抗氧化劑改善卵巢功能生育力

對抗氧化應激所導致的卵巢功能損傷，關鍵在于恢復ROS與抗氧化體系的動態平衡，一方面減少ROS的生成，另一方面刺激內源性抗氧化體系活性或是補充外源性抗氧化物質以增強清除ROS的能力。到目前為止，眾多的研究者在此課題上取得了顯著的研究成果，以下我們將介紹幾種療效突出有較好研究前景的抗氧化劑。

1.褪黑素(melatonin)：褪黑素是一類由松果體腺細胞合成及分泌的吲哚類激素。已有大量研究表明褪黑素因為其明顯的抗氧化效應可以用于防治衰老、缺血再灌注損傷及放射治療等所導致的氧化應激損傷。褪黑素能直接清除活性氧自由基，促進谷胱甘肽的合成，減輕氧化應激對線粒體蛋白及DNA的損傷[9]。有研究者指出人類卵泡液內的褪黑素能緩和氧化應激從而保護卵母細胞和顆粒細胞，而高齡女性的卵泡液內的褪黑素會顯著減少[10]。研究表明褪黑素能抑制順鉑(cisplatin)所導致的雌性小鼠始基卵泡池儲備的丟失。順鉑激活細胞內的磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT)信號轉導通路，使AKT磷酸化(AKT的活化)，AKT的磷酸化又會促使轉錄因子叉頭框蛋白O3a(forkhead Box O3a，FOXO3a)磷酸化(無活性狀態)，從而使具有活性的非磷酸化形式的FOXO3a明顯減少。而沉默信息調節因子1(sirtuin1,SIRT1)通過使FOXO3a去乙酰化從而激活細胞核內的MnSOD及過氧化氫酶(catalase)，以達到清除活性氧的作用。因此順鉑導致的PI3K/AKT通路的激活會抑制FOXO3a介導的抗氧化效應，誘發氧化應激損傷卵泡內的細胞。給小鼠注射褪黑素后，明顯抑制了順鉑所誘發的PI3K/AKT通路的激活，抑制了AKT的磷酸化，增強了非磷酸化形式的FOXO3a介導的抗氧化效應(圖1)，從而緩解了順鉑導致的始基卵泡儲備的丟失[11]。

2.1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)：S1P來源于鞘脂類，而鞘脂類不僅是生物膜的重要組成成分，還調節著細胞生命活動中的信號轉導過程。有研究指出S1P可以抑制H202誘發的人顆粒細胞的凋亡[12]。氧化應激可以促進神經酰胺(ceramide)的合成，高齡女性卵巢內神經酰胺含量顯著增加，而神經酰胺是誘發細胞凋亡的途徑之一，S1P可以通過抑制神經酰胺的活性從而抑制高齡女性卵巢卵母細胞的凋亡[13]。S1P還可以通過抑制神經酰胺的活性來抑制環磷酰胺(cyclophosphamide)和阿霉素(doxorubicin)所導致的人始基卵泡的丟失[14]。氧化應激會損傷線粒體內膜及內膜上參與電子傳遞的線粒體蛋白，使電子傳遞過程中電子漏出導致大量ROS的產生。同時，氧化應激會損傷線粒體DNA，導致維持線粒體功能的過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活子1α(peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α,PGC-1α)活性降低，并且抑制MnSOD和GSH的生成，進一步加重氧化應激。S1P可以增強線粒體內膜防御氧化應激損傷的能力，抑制電子漏出導致的ROS的生成，同時S1P可以激活PGC-1α，增強線粒體的功能以防御氧化應激[15-16](圖1)。

3.三氯合碲酸銨(AS101)：三氯合碲酸銨[(ammonium trichloro(dioxoethylene-o,o′)tellurate，AS101)]是一種人工合成的低分子量的含碲化合物，其作為免疫調節劑目前在臨床試驗階段用于增強腫瘤患者的免疫功能。最近有研究發現AS101能夠抑制環磷酰胺所導致的線粒體內MnSOD的失活和GSH生成減少，即增強了MnSOD和GSH的抗氧化效應，同時AS101還增強了PGC-1α的活性改善了線粒體功能，最終抑制了環磷酰胺所導致的小鼠始基卵泡儲備的下降[17]。此外，與褪黑素相似，AS101也可以抑制氧化應激對 PI3K/AKT信號轉導通路的激活，從而抑制AKT及FOXO3a磷酸化，使得具有活性的非磷酸化的FOXO3a效應增強，進而激活MnSOD及catalase(圖1)，最終實現抑制氧化應激導致的生長卵泡的凋亡，從而抑制了始基卵泡的募集[18]。

4.輔酶Q10(coenzyme Q10，CoQ10)：CoQ10是線粒體內膜上電子傳遞鏈的組成部分，參與電子的傳遞和ATP的生成。因此，隨著年齡增長導致的CoQ10的缺失，或是氧化應激直接損傷線粒體內膜上的CoQ10，都會影響正常的電子傳遞導致電子漏出，使ROS大量生成。此外，CoQ10可以激活線粒體內的MnSOD活性，增強抗氧化能力[19](圖1)。研究表明CoQ10可以抑制順鉑導致的大鼠卵泡的大量閉鎖，并且增強了卵泡內AMH(anti-Müllerian hormone)的表達。8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2 deoxyguanosine，8-OHDG)作為反映DNA氧化損傷的生物標記物，順鉑使大鼠卵泡內的8-OHDG表達增加，而CoQ10的添加可以抑制8-OHDG的表達，表明CoQ10可以抑制順鉑誘發的氧化應激損傷[20]。有研究表明CoQ10的添加能提高IVF-ICSI助孕過程中卵巢低反應患者的獲卵率、受精率及胚胎質量[21]。

圖1 幾種常見抗氧化劑對抗氧化應激的作用機制示意圖 OS：oxidative stress/氧化應激；ROS：reactive oxygen species/活性氧；PI3K：phosphatidylinositol3-kinase/磷脂酰肌醇3-激酶；AKT：serine/threonine kinase/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶；melatonin：褪黑素；P:phosphorylation/磷酸化作用；FOXO3a：forkhead Box O3a/叉頭框蛋白O3a；SIRT1:sirtuin1/沉默信息調節因子1；MnSOD：manganese superoxide dismutase/錳超氧化物歧化酶；catalase：過氧化氫酶；S1P：sphingosine-1-phosphate/1-磷酸鞘氨醇；AS101；ammonium trichloro(dioxoethylene-o,o′)tellurate/三氯合碲酸銨；CoQ10：coenzyme Q10/輔酶Q10；GSH：glutathione/谷胱甘肽；PGC-1α：peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α/過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活子1α；Mitochondrion：線粒體；Nucleus：細胞核；Cytoplasm：細胞漿

各種因素所誘發的氧化應激可以激活細胞內PI3K/AKT信號轉導通路，通過使AKT磷酸化(P)來可以抑制FOXO3a活性，從而抑制了FOXO3a在SIRT1去乙酰化作用下對錳超氧化物歧化酶(MnSOD)及過氧化氫酶(catalase)的激活作用。而褪黑素(melatonin)及AS101可以通過抑制PI3K/AKT轉導通路來活化FOXO3a，從而激活MnSod及過氧化氫酶。另一方面，氧化應激可以損傷線粒體使其呼吸鏈電子漏出導致線粒體內活性氧的產生，同時氧化應激可以抑制線粒體內MnSOD和谷胱甘肽(GSH)的生成以及PGC-1α蛋白的表達，從而進一步加劇了氧化應激對線粒體的損傷。而melatonin、S1P、AS101和CoQ10可以保護線粒體的結構及功能，增強線粒體內的MnSOD、GSH及PGC-1α，從而抑制氧化應激對線粒體的損傷。

5.其它類型抗氧化劑：白藜蘆醇(resveratrol)是一種提取自葡萄的天然多酚類化合物。研究者在大鼠實驗中發現六價鉻(Hexavalent chromium)顯著降低了作為細胞質中抗氧化物酶的谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase 1，GPx1)及抗凋亡蛋白的表達量，從而加劇卵巢組織內的氧化應激、導致卵泡內顆粒細胞及卵母細胞的凋亡及卵泡閉鎖。而白藜蘆醇的添加可以明顯上調GPx1的表達，緩和卵巢內的氧化應激以及卵泡的閉鎖與凋亡[22]。N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)是一種硫醇類抗氧化劑，其主要作用為干擾自由基的生成及清除已生成的自由基。有研究表明在人胎兒卵巢組織體外培養液中添加N-乙酰-L-半胱氨酸能促進卵泡的進一步發育[23]。此外，口服NAC也有可能改善PCOS患者的高胰島素素血癥及胰島素抵抗[24]。作為一種天然的抗氧化劑，維生素C可以使氧化型谷胱甘肽轉變為還原型谷胱甘肽，同時還原型谷胱甘肽有助于穩定還原型維生素C從而維持維生素C的抗氧化活性。維生素E通過與脂氧自由基反應從而阻斷脂過氧化物的生成，并且它能與維生素C協同增強各自的抗氧化能力[25]。

綜上所述，以上幾種抗氧化劑能有效的防御氧化應激對卵巢及卵泡的損傷，從而保存了始基卵泡的儲備，并維持卵巢正常的生理功能，因此有望成為改善高齡或是放化療及多囊卵巢綜合征所導致的卵巢損傷的一項有前景的治療方案。但是仍然需要更多的研究尤其是臨床試驗進一步驗證它們的有效性和安全性。此外，氧化應激損傷不僅局限于卵泡的生長成熟過程，還涉及受精、胚胎發育著床的過程；不僅作用于卵巢，還可作用于子宮內膜，因此應用抗氧化劑以防御氧化應激對女性整個生育過程的影響，有望提高受孕成功率[4,15,21]。