精氨酸等物質(zhì)對(duì)紫色紅曲菌產(chǎn)Monacolin K及紅曲色素的影響

朱倩倩，張 函，王海蛟，李穎慧，焦 梓，石嘉辰，王成濤,2，張 嬋,2，*

(1.北京工商大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048,2.北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048)

紅曲歷史悠久，盛產(chǎn)于福建，最為著名的是古田紅曲，常應(yīng)用于黃酒釀造、食品發(fā)酵以及色素生產(chǎn)等領(lǐng)域[1-2]。紅曲菌發(fā)酵可產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物，如Monacolin K[3]、紅曲色素[4]、γ-氨基丁酸[5]以及真菌毒素桔霉素[6]等，紅曲色素是紅曲菌在次級(jí)代謝過程中產(chǎn)生的一種由多種聚酮化合物組成的混合物[7]。天然紅曲色素具有抗菌、抗氧化等生物活性，具有廣泛的應(yīng)用前景。

Monacolin K也是一種有益的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是具有生理活性的聚酮類物質(zhì)，1979年日本遠(yuǎn)藤章教授在紅色紅曲菌(Monascusruber)發(fā)酵液中首次發(fā)現(xiàn)，并發(fā)現(xiàn)其可以減少膽固醇合成[8]。但由于Monacolin K產(chǎn)量較低，極大限制了紅曲菌的應(yīng)用。目前提高M(jìn)onacolin K產(chǎn)量的方法主要有2種：一是通過優(yōu)化發(fā)酵條件或者改進(jìn)培養(yǎng)基組分[3]；二是通過基因工程手段，如基因敲除及過表達(dá)等方法[9-10]。

實(shí)驗(yàn)前期以野生型菌株M1為實(shí)驗(yàn)菌株，通過在培養(yǎng)基中添加谷氨酸，發(fā)現(xiàn)Monacolin K產(chǎn)量提高了3.5倍[11]。利用HPLC-MS檢測(cè)代謝物，進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)添加和未添加谷氨酸的2組發(fā)酵液樣本中共檢測(cè)到上千種差異代謝物，根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)(FC>2、P<0.05、VIP>1)，最終篩選到可能與次級(jí)代謝產(chǎn)物Monacolin K的合成有關(guān)的10種物質(zhì)，分別是精氨酸、L-蘋果酸、D-葡萄糖、煙酰胺、α-酮戊二酸、苯丙氨酸、賴氨酸、焦磷酸硫胺素、黃素單核苷酸、L-乳酸。因此基于前期研究工作，選擇這10種物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)其對(duì)紫色紅曲菌中Monacolin K和紅曲色素產(chǎn)量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫色紅曲菌(Monascuspurpureus)M1，北京工商大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。PDA、葡萄糖、豆粕粉、甘油、蛋白胨、KH2PO4、NaNO3、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O，北京半夏科技發(fā)展有限公司；色譜級(jí)甲醇、無(wú)水乙醇、獨(dú)立濾器、0.45 μm濾器，北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；Monacolin K(純度≥98%)，美國(guó)Sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

20A型高效液相色譜儀、SPD-M20A型紫外檢測(cè)器、UV-2450 型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；LDZX-75KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；M-pact AX124 型分析天平，上海歡奧科技公司；超凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；SU8010 型掃描電子顯微鏡，日本日立公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1培養(yǎng)基配制

PDA培養(yǎng)基(g/L)[12]: PDA 37、瓊脂5。

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖30、大豆粉15、蛋白胨10、甘油70、KH2PO42、NaNO32、MgSO4·7H2O 1。

原始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):甘油90、大米粉20、蛋白胨10、KH2PO42.5、NaNO35、MgSO4·7H2O 1、ZnSO4·7H2O 2。

實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵培養(yǎng)基[13]：在原始發(fā)酵培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分基礎(chǔ)上分別添加精氨酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%、0.5%、0.6%)、L-蘋果酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%、0.2%、0.3%)、D-葡萄糖(質(zhì)量濃度10、20、30 g/L)、煙酰胺[14](質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、1.0%、1.5%)、α-酮戊二酸[15](質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、1.0%、1.5%)、苯丙氨酸(質(zhì)量濃度1、2、3 g/L)、賴氨酸[16](質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%、0.2%、0.3%)、焦磷酸硫胺素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%、0.3%、0.4%)、黃素單核苷酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%、0.5%、0.6%)和L-乳酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%、0.2%、0.3%)。

1.3.2菌種培養(yǎng)

將M1菌株在PDA培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)3 d，活化2代，用接種環(huán)從培養(yǎng)基上刮取1環(huán)菌液到種子培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)2 d。M1菌株在種子液中培養(yǎng)24 h，顏色變?yōu)闇\粉色后，將種子液按10%的接種量分別接到原始發(fā)酵培養(yǎng)基(對(duì)照組)、精氨酸-發(fā)酵培養(yǎng)基、L-蘋果酸-發(fā)酵培養(yǎng)基等10種實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵培養(yǎng)基中。30 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h，25 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 d。檢測(cè)各培養(yǎng)基中Monacolin K及紅曲色素產(chǎn)量，進(jìn)而確定最佳添加物。

1.3.3色譜條件

色譜柱為Inertsil ODS-3 C18(150 mm×4.6 mm×5 μm)；流動(dòng)相為0.1% 磷酸水溶液、甲醇(體積比1∶3)，流速1 mL/min；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)237 nm，檢測(cè)溫度30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.4Monacolin K產(chǎn)量測(cè)定

發(fā)酵液的預(yù)處理：取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵液各5 mL，加入15 mL體積分?jǐn)?shù)75%的甲醇，超聲萃取30 min，靜置過夜，取上清液經(jīng)0.45 μm的有機(jī)濾膜過濾，參考王蘭[17]方法檢測(cè)濾液中Monacolin K含量。將Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋成5、20、50、80、100、150、200 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后經(jīng)HPLC檢測(cè)后得到標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸曲線方程，計(jì)算樣品中Monacolin K含量。

1.3.5色價(jià)的測(cè)定

取發(fā)酵液5 mL，加入15 mL體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液，于恒溫水浴鍋60 ℃浸提1 h，靜置。用分光光度計(jì)測(cè)定410、448、505 nm處吸光度[18]。根據(jù)式(1)計(jì)算色價(jià)(U/mL)。

紅曲色素色價(jià)=OD505/448/410×稀釋倍數(shù)。

(1)

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Origin軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，每組樣品進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 Monacolin K產(chǎn)量分析

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到回歸曲線方程，計(jì)算樣品中Monacolin K含量。其中橫坐標(biāo)(x)為質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)(y)為峰面積，R為相關(guān)系數(shù)，得到的回歸方程為y=32 821x-57 678,R2=0.998。圖1顯示Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間在22.9 min左右。

2.1.2Monacolin K產(chǎn)量測(cè)定結(jié)果

添加不同物質(zhì)發(fā)酵后Monacolin K產(chǎn)量變化如圖2。精氨酸、煙酰胺、苯丙氨酸、賴氨酸以及黃素單核苷酸的添加對(duì)Monacolin K產(chǎn)量提高的效果較好。分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%、0.5%和0.6%的精氨酸時(shí)，第8天Monacolin K產(chǎn)量分別提高至對(duì)照組的2.66、2.86和3.65倍，達(dá)到了193.1、207.6、265.1 mg/L；而第15天的Monacolin K產(chǎn)量分別提高至2.72、2.24和2.89倍，達(dá)到了428.0、351.9、455.3 mg/L。當(dāng)苯丙氨酸添加量為2 g/L時(shí)，第15天的Monacolin K產(chǎn)量與對(duì)照組相比提高至1.39倍；而添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的賴氨酸時(shí)，Monacolin K產(chǎn)量提高至1.37倍，推測(cè)發(fā)酵液中添加有機(jī)氮源的效果比無(wú)機(jī)氮源好。柴詩(shī)緣等[18]在紅曲菌中添加山藥粉、谷氨酸等10種物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)添加谷氨酸后可極顯著提高M(jìn)onacolin K的產(chǎn)量，提高了5.60倍，也說(shuō)明了氨基酸類物質(zhì)的添加有助于Monacolin K的產(chǎn)生。當(dāng)煙酰胺添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，其Monacolin K產(chǎn)量在第15天提高到324.0 mg/L，相比于原始培養(yǎng)基提高至2.06倍。但是煙酰胺添加量增加后，反而對(duì)Monacolin K有抑制作用。黃素單核苷酸添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%時(shí)，第15天的Monacolin K提高至1.76倍。添加不同量的L-蘋果酸、D-葡萄糖、焦磷酸硫胺素以及L-乳酸時(shí)，結(jié)果與對(duì)照組沒有明顯差異。α-酮戊二酸的添加反而降低了Monacolin K產(chǎn)量，對(duì)Monacolin K合成有抑制作用，推測(cè)α-酮戊二酸的積累抑制了乙酰輔酶A的合成，進(jìn)而抑制了Monacolin K的產(chǎn)生。

**表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05)。

三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))是由一系列酶促反應(yīng)組成的循環(huán)反應(yīng)體系，由乙酰輔酶A 與草酰乙酸的縮合反應(yīng)作為起始反應(yīng)[19]。由于乙酰輔酶A作為TCA循環(huán)與Monacolin K合成的共同關(guān)鍵物質(zhì)，推測(cè)TCA循環(huán)與Monacolin K的調(diào)控途徑在很大程度上互相影響。而L-蘋果酸、α-酮戊二酸參與三羧酸循環(huán)，因此通過這2種物質(zhì)添加可以判斷L-蘋果酸、α-酮戊二酸對(duì)Monacolin K的影響。同時(shí)焦磷酸硫胺素是α-酮戊二酸氧化脫羧酶系的輔酶，也參與TCA循環(huán)，因此通過焦磷酸硫胺素的添加，可探究焦磷酸硫胺素對(duì)Monacolin K的影響。紅曲液態(tài)發(fā)酵需要碳源和氮源，D-葡萄糖是有機(jī)碳源，而添加的精氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸等氨基酸類可以作為有機(jī)氮源促進(jìn)紅曲菌的生長(zhǎng)代謝及次級(jí)代謝產(chǎn)物的生成。煙酰胺是NADH和NADPH合成的前體物質(zhì)，在臨床上也應(yīng)用于高血壓患者的治療。黃素單核苷酸是氧化還原酶的輔基，能夠參與糖、脂肪、蛋白質(zhì)的代謝。L-乳酸則可以在乳酸脫氧酶的作用下，轉(zhuǎn)變?yōu)楸徇M(jìn)而被氧化生成Monacolin K合成前體物質(zhì)-乙酰輔酶A。

與紅曲菌固態(tài)發(fā)酵相比，液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)Monacolin K更適用于大批量生產(chǎn)，也更節(jié)約成本和空間，但是紅曲菌產(chǎn)生的Monacolin K產(chǎn)量較低，一些學(xué)者從發(fā)酵液營(yíng)養(yǎng)成分的角度來(lái)提高M(jìn)onacolin K產(chǎn)量。趙薇等[20]在叢毛紅曲菌液態(tài)發(fā)酵中通過添加不同來(lái)源的碳源來(lái)探討對(duì)Monacolin K產(chǎn)量的影響，研究發(fā)現(xiàn)：添加生物柴油粗甘油和脂肪醇粗甘油，Monacolin K產(chǎn)量較對(duì)照組提高10.6倍。劉麗等[21]在紅曲菌發(fā)酵液中添加800 μmol/L水楊酸和150 μmol/L茉莉酸甲酯后，發(fā)現(xiàn)Monacolin K分別增加了66.0%和64.5%。邱源等[22]在培養(yǎng)基中添加Zn2+，發(fā)現(xiàn)對(duì)Monacolin K產(chǎn)量提高效果最為顯著。黃勛等[23]采用發(fā)芽大豆并2種紅曲菌共發(fā)酵，在發(fā)酵第3天加入釀酒酵母破壁液，對(duì)Monacolin K產(chǎn)量提高效果較好。他們分別是通過添加營(yíng)養(yǎng)因子、信號(hào)分子以及加速細(xì)胞壁破裂等方式促進(jìn)Monacolin K的產(chǎn)生。而本研究是通過非靶向代謝組學(xué)分析后，推測(cè)Monacolin K合成通路中可能的相關(guān)物質(zhì)會(huì)對(duì)Monacolin K合成有一定影響，進(jìn)而去驗(yàn)證這些物質(zhì)對(duì)Monacolin K等次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的影響。

2.2 紅曲色素色價(jià)分析

2.2.1紅色素檢測(cè)結(jié)果

賴氨酸以及黃素單核苷酸的添加對(duì)紅曲紅色素合成具有促進(jìn)作用，見圖3。添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%和0.3%的賴氨酸在發(fā)酵第8天可使紅色素產(chǎn)量提高至2倍以上，第15天的產(chǎn)量分別提高為對(duì)照組的1.36倍和1.33倍；添加黃素單核苷酸后，第15天的紅色素產(chǎn)量分別提高至對(duì)照組的1.84、1.54、1.71倍，達(dá)到了35.60、29.80、33.03 U/mL。當(dāng)精氨酸添加量為0.4%時(shí)，第15天其紅色素相對(duì)于對(duì)照組提高至1.27倍。L-蘋果酸、D-葡萄糖、苯丙氨酸、焦磷酸硫胺素和L-乳酸的添加對(duì)紅色素?zé)o明顯促進(jìn)作用。而添加煙酰胺和α-酮戊二酸后對(duì)紅色素合成具有抑制作用。

**表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05)。

2.2.2橙色素檢測(cè)結(jié)果

賴氨酸、苯丙氨酸以及黃素單核苷酸的添加對(duì)橙色素合成具有促進(jìn)作用，見圖4。其中黃素單核苷酸的效果最好，在紅曲菌發(fā)酵液中添加后，發(fā)酵第15天橙色素產(chǎn)量分別提高至對(duì)照組的2.98、2.51和2.72倍，達(dá)到了42.84、36.09、39.24 U/mL。賴氨酸的添加也使第8天橙色素產(chǎn)量提高至1.5～2.0倍。添加2 g/L的苯丙氨酸使橙色素的產(chǎn)量在第15天較對(duì)照組提高至1.2倍左右。D-葡萄糖、焦磷酸硫胺素的添加對(duì)橙色素含量無(wú)明顯提高，而L-蘋果酸和煙酰胺的添加對(duì)橙色素的產(chǎn)生有抑制作用。

**表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05)。

2.2.3黃色素檢測(cè)結(jié)果

苯丙氨酸、賴氨酸以及0.5%和0.6%的黃素單核苷酸的添加對(duì)黃色素合成有促進(jìn)作用，見圖5。添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、0.2%、0.3%的賴氨酸后第8天的黃色素產(chǎn)量分別為46.94、55.67、55.35 U/mL，提高至對(duì)照組的1.51、1.80、1.79倍。苯丙氨酸的添加主要在發(fā)酵后期起促進(jìn)作用，添加質(zhì)量濃度為2 g/L和3 g/L的苯丙氨酸在第15天的黃色素產(chǎn)量提高至1.23倍和1.46倍。煙酰胺、L-蘋果酸以及α-酮戊二酸的添加對(duì)黃色素的產(chǎn)生具有抑制作用；精氨酸、焦磷酸硫胺素和L-乳酸3種物質(zhì)的添加對(duì)黃色素的產(chǎn)生影響不大。

**表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05)。

通過對(duì)紅曲色素的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，苯丙氨酸、賴氨酸和黃素單核苷酸可以大幅提高紅曲色素產(chǎn)量。張斌等[24]曾探究20種氨基酸的添加對(duì)紅曲色素的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)精氨酸對(duì)紅曲色素的產(chǎn)生促進(jìn)效果不明顯，而苯丙氨酸和賴氨酸對(duì)紅曲色素具有促進(jìn)作用，與本研究結(jié)果一致。朱曉萍等[25]將茶多酚作為一種調(diào)控因子添加到紅曲菌發(fā)酵液中，發(fā)現(xiàn)紅曲色素總色價(jià)提高1.03倍，黃色素比例提高了7.4%。王艷等[26]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基配方為葡萄糖60 g/L、蛋白胨26 g/L、FeSO40.9 g/L、L-谷氨酸2 g/L和初始pH 值4.5時(shí)，紅曲色素色價(jià)比優(yōu)化前提高了3.13倍。紅曲色素具有良好的穩(wěn)定性、耐熱性、耐光性且安全無(wú)毒，在食品添加劑、紡織品、化妝品和藥品等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用[27]；因此，對(duì)紅曲色素產(chǎn)量提高的研究也具有重要意義。

3 結(jié) 論

本研究通過在紫色紅曲菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加精氨酸等10種物質(zhì)，探究了這些物質(zhì)對(duì)于Monacolin K產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)精氨酸、煙酰胺、苯丙氨酸、賴氨酸以及黃素單核苷酸對(duì)Monacolin K產(chǎn)量具有促進(jìn)作用。其中添加精氨酸后促進(jìn)效果最好，第15天的產(chǎn)量可達(dá)到455.3 mg/L，提高至原始培養(yǎng)基的2.89倍；其次為煙酰胺，提高至2.06倍，但前期煙酰胺對(duì)于Monacolin K的產(chǎn)生具有抑制作用。在提高M(jìn)onacolin K產(chǎn)量的同時(shí)，賴氨酸、苯丙氨酸和黃素單核苷酸對(duì)紅曲色素的產(chǎn)生也有促進(jìn)作用。關(guān)于精氨酸等物質(zhì)添加影響紅曲菌產(chǎn)Monacolin K的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。