外源營養(yǎng)因子對巴爾喀什蘑菇菌絲的影響

羅 影，關(guān)永強(qiáng)，祁正祥，郝敬喆，努爾孜亞·亞力買買提，魏 鵬，賈文捷，賈培松

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，烏魯木齊 830091；2. 新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，烏魯木齊 830002，3. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】巴爾喀什蘑菇(AgaricusbalchaschensisSamgina & G. A. Nam)屬擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)，層菌綱(Hymenomycetes)，傘菌目(Agaricales)，蘑菇科(Agaricaceae)，蘑菇屬(Agaricus)，又稱焉耆黑蘑菇、博湖蘑菇、蘆葦蘑菇等，屬于中亞地區(qū)特有種，主要生長在內(nèi)陸湖泊沿岸，蘆葦腐殖質(zhì)豐富的沙灘上，常埋于沙層中。其子實(shí)體碩大，群生或散生，肉質(zhì)緊實(shí)鮮嫩，風(fēng)味獨(dú)特，營養(yǎng)豐富[1-3]。據(jù)報(bào)道，其子實(shí)體中粗蛋白質(zhì)含量44.09%，粗脂肪含量2.07%，粗纖維含量10.89%，無氮浸出物含量32.27%，灰分含量10.68%，并含有17種氨基酸，其中7種為必需氨基酸[4,5]。前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其野生子實(shí)體中還含有多糖、苷類、有機(jī)酸、酚類、鞣質(zhì)類、甾體類、三萜類、黃酮類、內(nèi)酯類、揮發(fā)油類等化學(xué)成分[6]。巴爾喀什蘑菇名副其實(shí)的是一種高蛋白、低脂肪、高纖維，并富含多種礦物質(zhì)營養(yǎng)。影響食用菌生長發(fā)育的因素很多，碳源為其提供生長物質(zhì)和代謝能量，營養(yǎng)需求關(guān)系中細(xì)胞的生長代謝需要碳源提供碳架和能量。氮源主要用于合成食用菌生長發(fā)育過程中生成的蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)。礦質(zhì)元素在維持細(xì)胞內(nèi)滲透壓平衡，和作各種酶的激活因子與輔助因子中作用重大，若其供給異常，則會導(dǎo)致菌體形態(tài)及生理生化性質(zhì)發(fā)生改變。除此之外，往培養(yǎng)基中添加一定量的維生素、核苷酸、植物生長調(diào)節(jié)劑也能調(diào)節(jié)菌體內(nèi)酶活性，改變細(xì)胞膜通透性，促進(jìn)菌體營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和特定蛋白的表達(dá)，調(diào)控食用菌的生殖生長[7-10]。開展外源營養(yǎng)因子對巴爾喀什蘑菇菌絲生長影響的研究，對于巴爾喀什蘑菇的馴化栽培具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。【前人研究進(jìn)展】劉玉芳[11-12]針對關(guān)鍵環(huán)境因子包括溫度、光照、pH和培養(yǎng)料含水量對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響進(jìn)行了研究。張孔金[13]對野生巴爾喀什黑傘進(jìn)行了分離鑒定及其生物學(xué)特性研究。郝敬喆[14]對野生巴爾喀什蘑菇的馴化栽培和漆酶活性進(jìn)行了研究。【本研究切入點(diǎn)】目前對于無機(jī)鹽、維生素和植物生長調(diào)節(jié)劑等對巴爾喀什蘑菇菌絲生長影響鮮有報(bào)道。研究巴爾喀什蘑菇菌絲生長有影響的外源營養(yǎng)因子。【擬解決的關(guān)鍵問題】以新疆野生巴爾喀什蘑菇分離菌株為試材，采用單因素方法進(jìn)行試驗(yàn)，分析不同外源營養(yǎng)因子，包括碳源、氮源、培養(yǎng)料、無機(jī)鹽、維生素和植物生長調(diào)節(jié)劑，對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響為優(yōu)質(zhì)栽培和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株

巴爾喀什蘑菇菌株為新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，磷酸二氫鉀3 g，無水硫酸鎂1.5 g，瓊脂20 g，pH自然。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL ，pH自然。

1.2 方 法

1.2.1 菌種活化

將低溫保藏的巴爾喀什蘑菇菌種接種到PDA平板培養(yǎng)基上，25℃恒溫黑暗培養(yǎng)，待菌絲長滿平板備用。

1.2.2 平板實(shí)驗(yàn)法

每個平皿中央定量接種直徑5 mm的巴爾喀什蘑菇菌絲塊，25℃恒溫黑暗培養(yǎng)，測定不同外源因子對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響，主要以菌絲生長速度為指標(biāo)，同時觀察菌落的形態(tài)特征、菌絲長勢、菌落色澤等，所有試驗(yàn)均采用90 mm的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基用量20 mL/皿[15,16]。

1.2.3 碳源對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響

采用平板實(shí)驗(yàn)法，固定基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳素含量，碳源更換為與葡萄糖等量碳素的果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇、可溶性淀粉等8個碳源，以無糖培養(yǎng)基為對照，每個處理5個重復(fù)。研究不同碳源對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響。

1.2.4 氮源對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響

采用平板實(shí)驗(yàn)法，固定基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮素含量，氮源更換為與蛋白胨等量氮素的有機(jī)氮源(牛肉膏、牛肉粉、酵母浸粉、酵母膏、酸水解酪蛋白、甘氨酸、賴氨酸、精氨酸鹽酸鹽、苯丙氨酸、甲硫氨酸)和無機(jī)氮源(硫酸銨、草酸銨、氯化銨、檸檬酸銨、酒石酸銨、硝酸鉀、尿素)，以無氮培養(yǎng)基為對照，每個處理5個重復(fù)，研究不同氮源對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響。

1.2.5 培養(yǎng)料對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響

采用平板實(shí)驗(yàn)法，在PDA培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加等量常見培養(yǎng)料，篩選適合巴爾喀什蘑菇培養(yǎng)的原種培養(yǎng)基，選擇食用菌栽培種常用的15種培養(yǎng)料，磨成粉末，過篩，加入到PDA培養(yǎng)基中，每個處理5個重復(fù)，以PDA培養(yǎng)基為對照，考察不同培養(yǎng)料對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響。

1.2.6 無機(jī)鹽對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響

采用平板實(shí)驗(yàn)法，在PDA培養(yǎng)基中加入不同比例的硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸鈣、碳酸鈣、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅，以PDA培養(yǎng)基為對照，每個處理5個重復(fù)，研究不同無機(jī)鹽對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響。

1.2.7 維生素對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響

采用平板實(shí)驗(yàn)法，在PDA培養(yǎng)基中加入不同比例的維生素B1(硫胺素)、維生素B2(核黃素)、維生素B3(煙酸)、維生素B5(泛酸)、維生素B6(吡哆醇類)、維生素H(生物素)、維生素B9(葉酸)、維生素B12(氰鈷胺素)、維生素B-h(肌醇)、維生素C(抗壞血酸)，以PDA培養(yǎng)基為對照，每個處理5個重復(fù)，研究不同維生素對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響。

1.2.8 植物生長調(diào)節(jié)劑對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響

采用平板實(shí)驗(yàn)法，在PDA培養(yǎng)基中加入不同比例的吲哚乙酸(IAA)、萘乙烯(NAA)、6-芐氨基嘌呤(6-BA)、6-糠氨基嘌呤(6-KT)、赤霉素、三十烷醇、腐植酸鈉，以PDA培養(yǎng)基為對照，每個處理5個重復(fù)，研究不同植物生長調(diào)節(jié)劑對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響

研究表明，巴爾喀什蘑菇在8種碳源培養(yǎng)基上均能生長，但在不同碳源培養(yǎng)基上，菌絲生長有較大差異。以可溶性淀粉為碳源時，菌絲生長速度最快，達(dá)(1.40±0.04) mm/d，與對照和其他6種碳源存在顯著差異，且從菌絲濃密度和菌絲長勢上看，其菌絲最濃密，長勢最好。最佳碳源為可溶性淀粉，巴爾喀什蘑菇更容易利用多糖物質(zhì)。表1，圖1

表1 不同碳源下巴爾喀什蘑菇菌絲生長變化Table 1 Effects of different carbon sources on the mycelial growth of Agaricus balchaschensis

2.2 氮源對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響

研究表明，巴爾喀什蘑菇在18種氮源培養(yǎng)基上均能生長，包括有機(jī)氮、氨基酸、無機(jī)氮化合物等，且不添加氮源時也能生長，但在不同氮源培養(yǎng)基上，菌絲生長有較大差異。其中以有機(jī)氮為氮源時菌絲相對濃密，菌絲長勢較好，且以酵母膏為氮源時，菌絲最為濃密粗壯，其次是酵母浸粉、牛肉膏、牛肉粉、蛋白胨，但對其生長速度影響差異不顯著，以酸水解酪蛋白為氮源時，生長速度最快，達(dá)(1.06±0.05)mm/d，無氮源和牛肉膏為氮源時次之；而以氨基酸和無機(jī)氮為氮源時，會抑制其菌絲濃密度。最佳氮源為牛肉膏。表2，圖2

表2 不同氮源下巴爾喀什蘑菇菌絲生長變化Table 2 Effects of different nitrogen sources on the mycelial growth of Agaricus balchaschensis

2.3 培養(yǎng)料對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響

研究表明，PDA培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)料粉末，巴爾喀什蘑菇的菌絲濃密度顯著增強(qiáng)，菌絲生長速度也明顯加快，大多常見培養(yǎng)料均適合巴爾喀什蘑菇菌絲的生長。其中加入木屑粉和棉籽殼發(fā)酵料時，生長速度最快，與對照差異顯著，達(dá)1.75 mm/d。在加入營養(yǎng)土1、營養(yǎng)土2、木屑粉、蘆葦基質(zhì)及棉籽殼發(fā)酵料的培養(yǎng)基上容易形成菌絲凝集，產(chǎn)生原基。培養(yǎng)巴爾喀什蘑菇較為合適的培養(yǎng)料有木屑、棉籽殼發(fā)酵料、麥草和蘆葦基質(zhì)。表3，圖3

表3 不同培養(yǎng)料下巴爾喀什蘑菇菌絲生長變化Table 3 Effects of different culture medium on the mycelial growth of Agaricus balchaschensis

2.4 無機(jī)鹽對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響

研究表明，不同無機(jī)鹽對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響效果有明顯差異。加入3種不同形式的Ca2+在低濃度時，對巴爾喀什蘑菇的生長起促進(jìn)作用，之后隨著濃度升高，又表現(xiàn)出抑制作用。加入3種不同形式的Ca2+，均可明顯刺激巴爾喀什蘑菇菌絲發(fā)生凝結(jié)，形成原基。MgSO4和KH2PO4作為實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)真菌常加入的無機(jī)鹽，對巴爾喀什蘑菇并未有促進(jìn)作用，反而隨著濃度增加抑制作用明顯。MnSO4和FeSO4在低濃度時對巴爾喀什蘑菇的生長起促進(jìn)作用，之后隨著濃度升高，又表現(xiàn)出抑制作用。ZnSO4和CuSO4的添加，在供試低濃度內(nèi)對巴爾喀什蘑菇菌絲的生長起抑制作用。圖4，圖5

2.5 維生素對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響

研究表明，維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素H、維生素B9、維生素B-h和維生素C均能在一定范圍內(nèi)促進(jìn)巴爾喀什蘑菇的菌絲生長速率，維生素B3對其影響不大，而維生素B5和維生素B12有抑制作用。圖6

2.6 植物生長調(diào)節(jié)劑對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響

研究表明，供試植物生長調(diào)節(jié)劑對巴爾喀什蘑菇菌絲的生長在一定范圍內(nèi)均有一定的促進(jìn)作用，IAA、NAA、6-BA、赤霉素均表現(xiàn)在濃度小于0.1 mg/L時，有促進(jìn)作用，隨之濃度增大而表現(xiàn)為抑制作用；6-KT和腐殖酸鈉濃度小于0.8 mg/L時有促進(jìn)作用，且濃度為0.6 mg/L時，促進(jìn)作用最明顯；三十烷醇用95%乙醇溶解，對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響不明顯。圖7

3 討 論

巴爾喀什蘑菇是一種營養(yǎng)價值豐富的食用菌。目前該菌在實(shí)驗(yàn)室已實(shí)現(xiàn)人工栽培[13-14]，但是存在菌絲生長周期長，原基形成不統(tǒng)一，轉(zhuǎn)化率低等問題，制約其栽培推廣和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)[13-14]。研究從營養(yǎng)物質(zhì)角度探究不同外源營養(yǎng)因子對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響，以期為其優(yōu)質(zhì)栽培和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，綜合菌絲長勢和生長速度，巴爾喀什蘑菇菌絲生長的最佳碳源為可溶性淀粉，最佳氮源為牛肉膏，而張孔金[13]研究其最佳碳氮源為葡萄糖和蛋白胨，郝敬喆[14]研究最佳碳氮源為麥芽糖和可溶性淀粉、硝酸銨和蛋白胨。該實(shí)驗(yàn)差異可能與試驗(yàn)菌株差異或基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分差異有關(guān)，原因還需進(jìn)一步研究。適合巴爾喀什蘑菇栽培的培養(yǎng)料有木屑、棉籽殼發(fā)酵料、麥草和蘆葦基質(zhì)。PDA中加入不同無機(jī)鹽、維生素和植物生長調(diào)節(jié)劑，結(jié)果顯示ZnSO4和CuSO4在供試低濃度內(nèi)對巴爾喀什蘑菇菌絲的生長起抑制作用；MgSO4和KH2PO4作為實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)真菌常加入的無機(jī)鹽，對巴爾喀什蘑菇并未有促進(jìn)作用，反而隨著濃度增加抑制作用明顯；MnSO4、FeSO4、CaCl2、CaSO4和CaCO3在低濃度時對巴爾喀什蘑菇的生長起促進(jìn)作用，之后隨著濃度升高，又表現(xiàn)出抑制作用。其中3種不同形式的鈣離子，均可明顯刺激巴爾喀什蘑菇菌絲發(fā)生凝結(jié)，形成原基，造成這一現(xiàn)象的原因有待進(jìn)一步研究。另外，除維生素B3、三十烷醇對巴爾喀什蘑菇菌絲生長影響不明顯，維生素B5和維生素B12有抑制作用之外，其他供試的大多維生素和植物生長調(diào)節(jié)劑對巴爾喀什蘑菇菌絲生長均有促進(jìn)作用。研究只對影響巴爾喀什蘑菇菌絲生長的碳源、氮源、培養(yǎng)料、無機(jī)鹽、維生素和植物生長調(diào)節(jié)劑進(jìn)行了單因素分析，尚未進(jìn)行復(fù)合組合優(yōu)化，仍須進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

單因素平板法對新疆野生巴爾喀什蘑菇(Agaricusbalchaschensis)組織分離菌株進(jìn)行試驗(yàn)，添加不同外源營養(yǎng)因子，包括碳源、氮源、培養(yǎng)料、無機(jī)鹽、維生素和植物生長調(diào)節(jié)劑等，該菌菌絲生長的最佳碳、氮源為可溶性淀粉和牛肉膏，培養(yǎng)該菌較為合適的培養(yǎng)料有木屑、棉籽殼發(fā)酵料和蘆葦基質(zhì)，無機(jī)鹽(MnSO4、FeSO4、CaCl2、CaSO4、CaCO3)，維生素(B1、B2、B6、H、B9、B-h、C)，及植物生長調(diào)節(jié)劑(IAA、NAA、6-BA、6-KT、赤霉素和腐殖酸鈉)，均可在一定程度上促進(jìn)巴爾喀什蘑菇菌絲的生長。不同外源營養(yǎng)因子對巴爾喀什蘑菇菌絲的生長有不同程度的影響。