刺山柑果實醇提物正丁醇部位提取物抗炎鎮(zhèn)痛效果分析

張亞濤，包曉瑋，曾蘭君，魏晨業(yè)，何夢夢，金渭荃

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】刺山柑(CapparisspinosaL.)白花菜科山柑屬植物，又名野西瓜、老鼠瓜、槌果藤、菠里克果等，主要分布于中東地區(qū)和地中海國家以及中國新疆、甘肅、西藏等地[1-3]。刺山柑是藥食兩用植物，根皮、葉以及果實均可入藥，味辛苦，性溫，研究表明，刺山柑果實提取物在抗菌、抗炎、抗氧化、抗高血壓、抗腫瘤、降血糖、降血酯、利尿、治療痛風(fēng)和風(fēng)濕等方面均有一定的功效[4-12]。【前人研究進展】陳義磊等[13]證明了刺山柑果實中的黃酮類物質(zhì)具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用；張瑜[14]、高瑩瑩[15]、包曉瑋等[16]利用動物試驗，證明刺山柑黃酮具有抗炎、鎮(zhèn)痛效果；楊濤等[17]以抗炎、鎮(zhèn)痛活性為指標篩選刺山柑果實乙醇提取物、石油醚、乙酸乙酯萃取部位和水溶性部位得出刺山柑果實具有抗炎和鎮(zhèn)痛作用；蔣思思等[18]通過小鼠足腫脹試驗、二甲苯致小鼠耳廓腫脹動物試驗證明刺山柑果實水提取物具有良好的抗急性炎癥作用；朱曉薇等[19]研究刺山柑提取物不同極性部位的降血糖作用，認為刺山柑果實正丁醇提取物對鏈脲佐菌素所致的高血糖有著較好的活性；郭艷等[20]對刺山柑果實的5個化學(xué)部位分離，得出抗炎活性部位以及致敏部位，乙酸乙酯部位、甲醇部位具有顯著的抗炎活性，乙酸乙酯部位具有中度致敏性，甲醇部位無致敏性。【本研究切入點】有關(guān)刺山柑提取物的抗炎鎮(zhèn)痛活性研究報道很多，但有關(guān)刺山柑正丁醇萃取部位抗炎、鎮(zhèn)痛活性分析的研究報道未見。研究選取刺山柑乙醇提取物正丁醇部位進行抗炎鎮(zhèn)痛活性。【擬解決的關(guān)鍵問題】以總黃酮提取量為指標采用超聲波輔助提取法并結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化乙醇提取物最佳工藝，并將乙醇提取物浸膏通過萃取得到正丁醇部位。采用二甲苯致小鼠耳廓腫脹、小鼠腹腔毛細血管通透性分析正丁醇萃取部位抗炎效果；以熱板法和醋酸扭體分析正丁醇萃取部位鎮(zhèn)痛效果。研究刺山柑果實乙醇提取物正丁醇部位的抗炎鎮(zhèn)痛活性，為進一步開發(fā)利用刺山柑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 動物

KM小鼠200只，清潔級，體重(20±2)g，購于新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(SCXK(新)2018003)。

1.1.2 藥材與試劑

刺山柑成熟果實，購自新疆烏魯木齊。刺山柑 (新疆吐魯番野生果實) 、蘆丁標準品 (中國藥品生物制品檢定所, ≥97%) 、阿司匹林(Aspirin,ASP)(山東新華制藥股份有限公司，批號：H20030396)、地塞米松磷酸鈉注射液(天津金耀集團湖北天耀藥業(yè)股份有限公司，批號：H42020019)、氯化鈉注射液(河南科倫藥業(yè)有限公司，批號：H41023828)、氫氧化鈉、硝酸鈉、硝酸鋁、三氯化鋁、冰醋酸、二甲苯、伊文思蘭、CMC-Na等試劑(所用試劑均為分析純)。

1.1.3 儀器

搖擺式高速中藥粉碎機DFY-500(溫嶺市大德中藥器械限公司)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9240A(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)超聲波清洗器KQ5200DE(昆山市超聲儀器有限公司)、紫外可見分光光度計TU-1810(北京普析通用儀器責(zé)任有限公司)、AL204-IC電子天平 (梅特勒-托利多儀器上海有限公司)、RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀， (上海亞榮生化儀器廠) 、RB-200智能熱板儀(成都泰盟科技有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 響應(yīng)面試驗

以蘆丁標品為對照品，掃描200～800 nm，選定510 nm為檢測波長，繪制標準曲線，進行單因素試驗，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗，根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面試驗原理, 選擇乙醇濃度(A)、提取時間(B)、提取溫度(C), 利用Deign-Expert.V8.0.6以提取率為優(yōu)化目標, 進行3因素3水平響應(yīng)面分析。根據(jù)實驗方案進行后, 采用Design Expert軟件對實驗數(shù)據(jù)進行二次回歸擬合, 求得回歸方程, 預(yù)測刺山柑中黃酮的最佳工藝參數(shù)。表1

表1 響應(yīng)面分析因素及水平Table 1 Response surface analysis factors and levels

1.2.2 供試品溶液的制備

以總黃酮提取量為指標采用超聲波輔助提取法并結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化最佳提取工藝，并制備刺山柑乙醇提取物浸膏，取正丁醇部位浸膏用1%CMC-Na溶液配制正丁醇部位高劑量組、正丁醇部位中劑量組、正丁醇部位低劑量組和地塞米松、阿司匹林陽性對照，模型組均用0.9%NaCl(NS)溶液[20]。

1.2.3 抗炎試驗1.2.3.1 二甲苯致小鼠耳廓腫脹試驗

取小鼠50只，雌雄對半，隨機分為5組，每組10只。分別按正丁醇部位高(46.4 mg/(kg·d))、中(23.2 mg/(kg·d))、低(11.6 mg/(kg·d))試驗組及模型(NS)和陽性對照組(地塞米松10 mg/(kg·d))，0.1 mL/10g體重。每天1次給藥7 d，末次給藥1 h后，均勻涂抹二甲苯30 μL于小鼠右耳，左耳作為對照。致炎20 min后處死小鼠，取下雙耳用直徑8 mm的打孔器取相同部位耳廓，稱重，耳片重量之差為腫脹度，計算各試驗?zāi)[脹度抑制率。

腫脹抑制率(%)=

1.2.3.2 小鼠腹腔毛細血管通透性試驗

取小鼠50只，雌雄對半，給藥劑量和方法與1.2.3.1相同。分別于末次給藥1 h后，尾靜脈注射0.5%伊文思蘭(0.1 mL/10g)，立即腹腔注射0.6%醋酸溶液(0.3 mL/只)。20 min后，處死小鼠，剪開腹腔，用5 mL 0.9% NaCl溶液(NS)沖洗腹腔數(shù)次，收集洗滌液于5 mL容量瓶，用NS定容至刻度，3 000 r/min離心5 min，以NS為模型，于590 nm波長處測定上清液的吸收度(OD值)，記錄結(jié)果并計算毛細血管通透性抑制率。

毛細血管通透性抑制率(%)=

1.2.4 鎮(zhèn)痛試驗1.2.4.1 熱板法

取篩選合格雌性小鼠50只，隨機分為5組，每組10只。分別按正丁醇部位高(46.4 mg/kg·d)、中(23.2 mg/(kg·d))、低(11.6 mg/(kg·d))試驗組及模型(NS)和陽性對照組(阿司匹林(0.080 g/(kg·d))，0.1 mL/10g體重。分別于末次給藥后30、60、90、120 min按上述測定法分別測定痛閾值，計算其痛閾提高百分率。

痛閾值提高率(%)=

1.2.4.2 醋酸扭體法

取小鼠50只，雌雄對半，試驗分組及給藥劑量和方法與1.2.4.1相同。末次給藥后l h，根據(jù)體重腹腔注射0.6%醋酸溶液0.l mL/10g，5 min后，觀察并記錄15 min內(nèi)出現(xiàn)扭體次數(shù)，按下式計算扭體反應(yīng)抑制率。

扭體反應(yīng)抑制率(%)=

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理，用Deign-Expert.V8.0.6軟件設(shè)計響應(yīng)面試驗；用SPSS19.0數(shù)據(jù)處理軟件進行獨立樣本t檢驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面

研究表明，對其響應(yīng)值與各內(nèi)部因素進行回歸擬合，黃酮提取量與各因素變量的二次多項式回歸方程：Y=+30.68-0.15A+0.51B+0.61C+0.34AB-0.23AC-0.81BC-0.62A2-0.62B2-1.13C2。表2

表2 試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Test design and results

研究表明, 二次回歸方程整體模型極顯著 (P<0.01) , 同時失擬項不顯著, 該方程可以預(yù)測工藝方案。經(jīng)Deign-Expert.V8.0.6軟件處理, 得到了乙醇濃度(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖。各因素交互作用對果膠提取率的影響可由等高線圖看出來, 等高線圖形的形狀可以直觀的反映出交互影響的強弱, 等高線中圓形代表作用不顯著, 橢圓形代表作用顯著[21,22]。乙醇濃度與提取時間、乙醇濃度與提取溫度、提取時間與提取溫度的交互作用均顯著, 提取時間與乙醇濃度、提取時間與提取溫度、液料比與乙醇濃度的交互作用均不顯著。刺山柑黃酮提取對提取溫度的變化敏感。影響刺山柑黃酮提取率的各因素主次順序為提取溫度>提取時間>提取乙醇濃度，且提取溫度,提取時間的影響達到極顯著的水平。圖1～3

2.2 驗證試驗

根據(jù)得到的二次回歸方程，經(jīng)Deign-Expert.V8.0.6軟件處理，得到超聲波輔助法提取刺山柑黃酮的最優(yōu)提取參數(shù)條件為：提取溫度71.77℃，提取時間42.76 min，59.21%乙醇濃度，在此條件下刺山柑黃酮的得率理論上可達到30.808 5 mg/g。調(diào)整工藝參數(shù)為提取溫度72℃，提取時間43 min，60%乙醇濃度。在此參數(shù)下進行5組驗證性試驗，5次平均值黃酮提取率為30.791 9 mg/g，與理論值較為接近，RSD值為0.11%(n=5)，試驗方法重復(fù)性良好。表3～9

表3 最優(yōu)方案驗證性Table 3 Experimental results of optimal scheme validation (n=5)

2.3 抗 炎

2.3.1 二甲苯致小鼠耳廓腫脹

研究表明，刺山柑正丁醇部位不同劑量對甲苯致小鼠耳郭腫脹的影響不同，陽性對照藥(地塞米松)、正丁醇部位的高、中劑量組對模型(NS)組極顯著(P<0.01)，正丁醇部位低劑量組不顯著。表4

表4 刺山柑正丁醇部位下二甲苯致小鼠耳郭腫脹變化Table 4 Effects of n-butanol of capers on ear swelling induced by xylene in mice

2.3.2 小鼠腹腔毛細血管通透性

研究表明，刺山柑正丁醇部位不同劑量對小鼠腹腔毛細血管通透性具有不同影響，陽性對照藥(ASP)、正丁醇部位的高、中劑量組對模型(NS)組極顯著(P<0.01)，正丁醇部位低劑量組不顯著。表5

表5 刺山柑正丁醇部位下小鼠腹腔毛細血管通透性變化Table 5 Influence of capillaries permeability in mice abdominal cavity by n-butanol of capillaries

2.4 鎮(zhèn) 痛

2.4.1 熱板法鎮(zhèn)痛

研究表明，刺山柑正丁醇部位不同劑量對小鼠熱板法鎮(zhèn)痛試驗痛閾的影響，相對模型(NS)組，給藥組均能明顯提高小鼠熱板法試驗的痛閾，隨著作用時間延長，鎮(zhèn)痛效果越明顯，陽性對照組和高劑量組起效快，其他試驗組均顯示一定的鎮(zhèn)痛作用，正丁醇部位各劑量組持續(xù)時間長。

表6 刺山柑正丁醇部位下小鼠熱板法鎮(zhèn)痛試驗痛閾變化Table 6 Effects of capers n-butanol on pain threshold of hot plate analgesia test in mice

2.4.2 醋酸扭體法試驗

研究表明，刺山柑正丁醇部位不同劑量對小鼠醋酸扭體反應(yīng)具有一定的影響，陽性對照組(ASP)、正丁醇部位的高、中劑量組對模型(NS)組極顯著(P<0.01)，正丁醇部位低劑量組顯著(P<0.05)。表7

表7 刺山柑正丁醇部位下醋酸扭體反應(yīng)的鎮(zhèn)痛變化Table 7 Analgesic experiment of capers with n-butanol on acetic acid writhing

3 討 論

試驗在提取時間43 min，60%乙醇濃度，料液比1∶20，提取溫度72℃，超聲次數(shù)2次的條件下，刺山柑果實總黃酮的提取量為30.79 mg/g，提取率為3.079%。比王巖巖[23]選取刺山柑果實在纖維素酶輔助下提取刺山柑總黃酮(提取率為2.47%)的效率更高。與包曉瑋[16]選取刺山柑果實室溫下(70%乙醇濃度、液料比20∶1、超聲60 min)提取總黃酮(提取率2.21%)相比，具有增加溫度因素，升溫促進滲透和擴散，提高提取效率。刺山柑黃酮提取量的因素主次順序為提取溫度>提取時間>提取乙醇濃度，響應(yīng)面交互作用分析、預(yù)測最佳條件，驗證確定最佳工藝。在抗炎試驗中，正丁醇部位高劑量組對耳廓腫脹抑制率(33.33%)比楊濤等[17]山柑果實醇提物及不同萃取部位的抑制率都高(最高為32.2%)；對毛細血管通透性抑制率(12.8%)，皆表現(xiàn)為極顯著，刺山柑乙醇提取物正丁醇部位具有顯著抗炎活性。在鎮(zhèn)痛試驗中分別為和試驗中，正丁醇部位高、中劑量組能有效(P<0.01)提高小鼠熱板痛閾、減少醋酸致小鼠扭體的次數(shù)，說明刺山柑乙醇提取物正丁醇部位具有顯著外周性鎮(zhèn)痛作用和中樞性鎮(zhèn)痛作用。

4 結(jié) 論

最佳工藝為提取時間43 min，60%乙醇濃度，料液比1∶20，提取溫度72℃，超聲次數(shù)2次，在此條件下黃酮提取量為30.791 9 mg/g。通過二甲苯致小鼠耳廓腫脹、小鼠腹腔毛細血管通透性考察正丁醇萃取部位抗炎效果；以熱板法和醋酸扭體考察正丁醇萃取部位鎮(zhèn)痛效果。刺山柑果實的乙醇總提物的正丁醇萃取部位的抗炎、鎮(zhèn)痛效果較為顯著。