設施番茄病毒病病原鑒定

孫曉軍，周婷婷，玉山江·麥麥提，何 偉，羅文芳，許建軍，阿布都賽買提·吐爾送

(1.新疆農業科學院植物保護研究所，烏魯木齊 830091；2.新疆和田市農業技術推廣站，新疆和田 848000)

0 引 言

【研究意義】番茄(Solanum lycopersicum)是一種栽培較廣的蔬菜，亞洲最大的番茄種植基地在新疆。番茄作為新疆主要的特色經濟作物[1]，其種植面積穩定在78.76×103hm2以上，產量達792.540 7×104t[2]。番茄病毒病是限制番茄產業發展的重要因素之一，對番茄具有致病力的病毒種類高達136種[3]。【前人研究進展】徐晨曦等[4]對2013年采自我國的170個番茄樣本進行小RNA深度測序分析，鑒定出危害我國番茄的22種主要病毒，其采樣地點未包括新疆。危害新疆番茄的病毒主要有CMV、STV、ToMV和PVY，且以STV、CMV及ToMV的復合侵染為主[5]，目前未見ToCV危害新疆番茄的報道。番茄褪綠病毒(Tomatochlorosisvirus，ToCV)是一種世界性重要病害，該病毒寄主范圍廣，傳播迅速，潛伏期長，感病癥狀易與缺素癥混淆，對產量造成損失，成為危害我國番茄產業發展的重要病害[6]。檢測番茄褪綠病毒在新疆的發生狀況，有助于制定科學的防治措施，控制其傳播為害。ToCV屬長線形病毒科Clostreoviridae毛形病毒屬Crinivirus，是一種RNA病毒，不能通過機械摩擦接種傳播，由媒介昆蟲以半持久的方式傳播[7]。1998年在美國佛羅里達州發現ToCV[8]。2004年在中國臺灣發現該病毒[9]，目前在北京、天津、河北、河南、山東、湖南等地區已有該病毒的報道[10-16]。受ToCV感染的番茄表現為從中下部葉片顯癥并逐漸向上發展，葉脈間褪綠黃化，葉脈仍保持濃綠，感病葉片變脆且易折，與營養缺素癥相似，果實膨大和轉色遲緩。【本研究切入點】2019年秋，在新疆洛浦縣設施番茄上發現ToCV疑似病株，且設施內煙粉虱數量較多。研究設施中感病番茄的病原，對病樣進行分子檢測鑒定。【擬解決的關鍵問題】采集新疆和田地區洛浦縣不同溫室種植番茄，進行番茄葉片總RNA提取和RT-PCR檢測，并進行序列分析，分析番茄患病的病原，為新疆防控番茄病毒病的傳播和危害提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

番茄病葉樣品于2019年秋采集自新疆和田地區洛浦縣不同番茄種植溫室，共8份，將采集到的樣品放置于-80℃冰箱保存備用。

1.2 番茄葉片總RNA提取和RT-PCR檢測

研究采用反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)對病樣進行鑒定。采用天根生物技術有限公司(北京)制造的試劑盒說明書提取植物總RNA提取。根據制造商的說明書(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，北京)將植物總RNA反轉合成為cDNA。以cDNA為模板進行病毒的RT-PCR檢測，引物信息如表1。PCR反應體系均為：2×easyTaqsuper Mix 10 μL、正反向引物各0.4 μL(10 mmol/L)、cDNA 1 μL、ddH2O補足至20 μL。反應程序：95℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，35個循環；72℃ 10 min，4℃保存。PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。表1

表1 所用引物信息Table 1 Primer information used in this study

1.3 PCR產物克隆和測序

采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根生物技術有限公司，北京)回收PCR擴增到的特異性條帶，純化連接到pMD18-T克隆載體上，并轉化大腸桿菌菌株DH5α，隨機挑取3個陽性克隆送至華大基因公司測序。

1.4 序列分析

將得到的ToCVCP基因序列在NCBI網站中進行分析比對，根據比對結果，再選取NCBI上發布的ToCV分離物的CP基因完整序列。利用MEGA6.0軟件的Clustal W法進行多序列比對分析以及鄰接法(neighbor joining, NJ)構建系統進化樹，系統進化樹中各分支置信度(bootstrap)進行1 000次重復分析。

2 結果與分析

2.1 番茄感染ToCV的田間癥狀

研究表明：設施番茄葉片具有明顯的黃化現象，其癥狀和缺素癥很相似。病株葉片褪綠從下部向上部發展，葉肉褪綠黃化，葉脈仍維持綠色，葉片邊緣輕微向內卷曲，全葉變脆、增厚。圖1

2.2 RT-PCR檢測結果

研究表明，8份樣本中未檢測到TMV、CMV、ToMV、ToMMV，檢測到STV(圖2A)、TYLCV(圖2B)、ToCV(圖2C)，其檢出率分別為100%、100%、87.5%。表2，圖2

表2 洛浦縣番茄病毒病原鑒定Table 2 Identification of tomato virus disease in Luopu County

2.3 ToCVCP基因序列

研究表明，從檢測到ToCV的7個樣品中選出1個作為代表性樣本的PCR產物，克隆和測序得到774 bp序列，利用NCBI網站中BLAST功能對所得分離物的序列進行比對，該序列與ToCVCP基因序列相同，ToCV在新疆和田地區洛浦縣已有發生。CP基因的3個陽性克隆測序結果一致。

將中國新疆洛浦縣采集獲得的ToCV分離物的CP基因與NCBI上來自中國的24份、日本2份、韓國3份、土耳其15份、希臘5份、巴西1份、以色列1份，共計51份ToCVCP基因序列進行同源性分析。中國新疆洛浦縣ToCVCP基因序列與日本熊本(LC342729)和中國北京(KC311375)序列一致性達到99.74%，與來自中國其他地區19份、日本1份分離物的一致性達到99%以上。與來自中國其他地區的4份、希臘5份、土耳其14份、巴西1份、以色列1份，韓國的3份分離物的一致性達到98%～99%，與來自土耳其的1份分離物一致性達到96.12%。ToCVCP基因序列因分離物來源地區的不同而存在差異。中國新疆洛浦縣ToCVCP基因與國內其他地區CP基因具有較高一致性，中國新疆洛浦縣ToCVCP基因與希臘、土耳其、巴西、以色列等地區的分離物CP基因同源性較低。表3

表3 用于序列比較和進化分析的ToCV CP基因序列Table 3 Information of ToCV CP gene for sequence comparison and phylogenetic analysis

2.4 采集番茄病樣ToCV 分離物的進化

研究表明，中國新疆洛浦縣ToCVCP基因與中國北京、山東分離物的CP基因聚集在1個分支上，親緣關系較近。與來自中國25份和日本的2份分離物聚集在同一個大的分支上，與來自希臘、以色列、巴西、韓國、土耳其的分離物親緣關系相對較遠。不同地區的ToCVCP基因序列存在一定差異，相鄰地區的ToCVCP基因序列親緣關系較近。圖3

3 討 論

研究采集了新疆和田地區洛浦縣設施番茄疑似患病樣品，利用RT-PCR方法檢測患病植株葉片，經序列分析比對，造成新疆洛浦縣番茄葉片黃化的病毒主要是STV、TYLCV、ToCV。其中，ToCV在新疆侵染番茄作物，獲得新疆洛浦縣番茄分離物的CP全基因序列。中國新疆洛浦縣番茄分離物的CP核酸序列與GenBank登錄的ToCV的CP核酸序列一致性均在90%以上。采集自中國新疆洛浦縣番茄病樣中確定檢測到ToCV。

ToCV中國新疆洛浦縣分離物的CP核酸序列與日本熊本(LC342729)和中國北京(KC311375)CP核酸序列一致性達到99.74%，與來自亞洲地區分離物的一致性高于希臘、以色列、巴西、土耳其地區的分離物。ToCV中國新疆洛浦縣分離物與國內已報道分離物差異較小，與國外已報道分離物差異相對較大，中國新疆洛浦縣番茄ToCV可能來自國內某個番茄ToCV發生區。

在自然條件下，多種植物病毒復合侵染植株的現象較為普遍，研究發現在同一地點采集的同一樣本上也檢測出TYLCV和STV，表明在和田地區洛浦縣溫室秋延晚番茄上存在2種及以上病毒復合侵染的問題。由于ToCV和TYLCV發病規律類似，發病時間相同，且均可由煙粉虱傳播，2種病毒復合侵染產生的協生作用，將對番茄生產造成更大的經濟損失[17]。

目前，國內外還未見有番茄品種抗ToCV的報道，也缺乏針對性的防治藥劑。由于傳毒介體-煙粉虱是造成ToCV發生、蔓延的關鍵因素之一，所以，通過控制傳毒煙粉虱，阻斷傳播途徑等措施綜合防控ToCV。預防要做到早防早控，從播種、育苗、移栽、開花坐果直到采收，全程監測和防控傳毒介體-煙粉虱，尤其是加強前期關鍵時期的防控管理，才能有效遏制ToCV的擴散和危害。

研究番茄病毒病病原鑒定的病樣僅采自中國新疆和田地區洛浦縣，將擴大對新疆其他地區ToCV的檢測，進一步查明ToCV病毒在新疆發生分布的情況，為番茄病毒病的有效防治提供依據。

4 結 論

利用侵染番茄7種主要病毒的特異性引物對采自新疆洛浦縣設施番茄疑似感病樣品進行RT-PCR檢測，從8份病樣中檢測到南方番茄病毒病(Tomatoyellowleafcurlvirus，STV)、番茄黃化曲葉病毒病(Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV)、番茄褪綠病毒(Tomatochlorosisvirus，ToCV)，其檢出率分別為100%、100%、87.5%，未檢出煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)、黃瓜花葉病毒(CucumbermosaicCucumovirus，CMV)、番茄花葉病毒病(Tobaccomosaicvirus，ToMV)、番茄斑駁花葉病毒(Tomatomottlemosaicvirus，ToMMV)。對番茄褪綠病毒陽性樣品的CP基因進行克隆和序列分析，新疆洛浦縣番茄病樣分離物的CP基因的774個核苷酸序列與已報道的51個ToCVCP基因具有較高的同源性，與中國其它地區、日本、韓國、希臘、土耳其、巴西等地分離物一致性均達到96%以上，中國新疆洛浦縣番茄病樣分離的ToCVCP基因與北京、山東分離物的CP基因聚集在1個分支上，親緣關系較近。新疆洛浦縣設施番茄疑似病毒病植株的"黃化"現象，是由STV、TYLCV和ToCV中的2種或2種以上病毒復合侵染所致，并發現番茄褪綠病毒已傳播至新疆和田地區。