印跡基因PHLDA2在孕婦子癇前期胎盤中的差異表達和甲基化狀態(tài)

朱 好 胡 蓉 顧蔚蓉

（復旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院產(chǎn)科 上海 200011）

PLHLDA2（Pleckstrin homology-like domain，family A，member 2）是位于染色體11p15的母源性印跡基因，主要在胎盤中表達，既往研究發(fā)現(xiàn)PHLDA2與子代出生體重呈負相關［1-2］，通過促進滋養(yǎng)細胞凋亡、抑制滋養(yǎng)細胞侵襲，在妊娠并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用［3］。本研究采用Realtime PCR和焦磷酸甲基化測序方法檢測子癇前期孕婦胎盤組織中印跡基因PHLDA2的表達改變和甲基化差異，初步了解PHLDA2與子癇前期的關系。

資料和方法

研究對象 早發(fā)型子癇前期4例、晚發(fā)型子癇前期16例及正常對照組30例子代胎盤組織均來源于復旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院2017年6月—2018年12月分娩的產(chǎn)婦。各組孕婦知情同意將組織進行科學研究，本研究獲得復旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院倫理委員會批準（批件號：Kyy2016-42）。

納入標準 子癇前期組為根據(jù)《婦產(chǎn)科學》（第九版）［4］教材，符合子癇前期及慢性高血壓并發(fā)子癇前期，系自然妊娠且無其他妊娠合并癥者的胎盤組織；其中發(fā)病孕周＜34周者為早發(fā)型子癇前期，發(fā)病孕周≥34周者為晚發(fā)型子癇前期。正常對照組為自然妊娠且無妊娠合并癥者的胎盤組織。

排除標準 合并內科或外科的合并癥，包括糖尿病、腎炎、心臟病、貧血、肝炎、妊娠期肝內膽汁淤積癥、性傳播性疾病，以及其他孕婦內外科疾病。合并妊娠期或分娩期的并發(fā)癥，如前置胎盤、胎盤早剝、產(chǎn)時發(fā)熱、胎兒窘迫、羊水量異常、胎兒畸形、巨大兒、胎兒貧血、胎兒先天性疾病等。

妊娠結局及新生兒情況 記錄各組一般信息、分娩方式、孕齡和新生兒出生體重、Apgar評分等。

標本采集 胎盤娩出后立即無菌下留取母體面中央?yún)^(qū)胎盤組織（避開鈣化區(qū)），剪去表面蛻膜組織后，留取約200 mg組織塊，置凍存管中后置液氮罐中，30 min后轉移至-80℃冰箱儲存。

Real-time PCR取約直徑5 mm凍存胎盤組織加入1 mL Trizol，充分研磨后抽提總RNA，紫外分光光度儀測定RNA純度并計算其濃度。1%瓊脂糖凝膠電泳分析其產(chǎn)物，確定RNA完整性。采用20 μL反轉錄體系，試劑盒購自Invitrogen公司。NCBI查詢mRNA序列，primer3軟件篩選出一對cDNA引物（蘇州金唯智公司合成）。PHLDA 2上游引物序列5’-GCTTCCACTCCATCCTCAAG-3’，下游引物5’-GGTTCTGG-AAATCGATGAGC-3’，擴增片段長159 bp；GAPDH上游引物序列5’-GCGAGATCCCTCCAAAATCAA-3’，下游引物序列 5’-GTTCA-CACCCATGACGAACAT-3’，擴增片段長172 bp。使用7500 Fast Real-time PCR System，采用10μL反應體系，95℃預變性2 min，95℃變性5 s，60℃退火10 s，45個循環(huán)后反應結束，確認Realtime PCR的擴增曲線和融解曲線，進行PCR相對定量。目的基因mRNA的表達水平根據(jù)PCR擴增曲線所得CT值，以GAPDH基因為內參，比較內參基因與目的基因的CT值，得出各標本之間目的基因 表 達 量 的 多 少 。 計 算 公 式 ：ΔCT=CT目的基因-CT管家基因；相對含量（%）=2-ΔΔCT×100%，其中ΔΔCT=（CT目的基因-CT管家基因）實驗組-（CT目的基因-CT管家基因）對照組。

焦磷酸甲基化測序 啟動子區(qū)Cp G島引物由PyroMark Assay Design 2.0設計，由生工基因合成，所選擇Cp G島區(qū)域設計焦磷酸測序模板制備引物和測序引物。PHLDA 2上游引物序列5’-GTAATGGGTATAGTGATGTAAAAATAAGAT-3’，下游引物序列3’-CACAACTC-TCTAACCCAATCCTTTC-5’，測序引物序列 5’-ATTAGATAGTTTAATAATTTAAGG-3’。使用QIAGEN基因組DNA抽提試劑盒，從凍存胎盤組織中提取基因組DNA，計算所提取DNA含量并保存，對基因組DNA進行亞硫酸氫鹽處理。應用PyroMark Q48軟件對焦磷酸測序結果進行分析。

統(tǒng)計學分析 分析采用SPSS l7.0軟件包，計數(shù)資料采用χ2及Fisher精確檢驗；計量資料比較采用單因素方差分析及t檢驗，結果用表示。

結果

臨床資料 與正常對照組比較，早發(fā)型子癇前期組分娩孕周小（P＜0.000）、手術助產(chǎn)率高（P=0.015）、新生兒出生體重低（P＜0.000）、1 min低Apgar評分率高（P＜0.000）；晚發(fā)型子癇前期組手術助產(chǎn)率高（P=0.012），如表1所示。進一步比較早發(fā)型子癇前期在分娩孕周（P＜0.000）、出生體重（P＜0.000）、1 min低 Apgar評分發(fā)生率（P=0.003）較晚發(fā)型病情更早更重。本研究中有2例SGA均為早發(fā)型子癇前期，出生體重分別為1 650 g（35+2周）、1 720 g（36+4周），3組均無新生兒死亡。

子癇前期PHLDA2 mRNA的表達改變 用SYBR GreenⅠ熒光Real-time PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，晚發(fā)型子癇前期組胎盤PHLDA2的mRNA表達較對照組明顯降低（P=0.019），而早發(fā)型子癇前期與晚發(fā)型、正常對照組之間差異均無統(tǒng)計學意義，如表2所示。

表1 早發(fā)型、晚發(fā)型子癇前期組與正常對照組臨床資料的比較Tab 1 Clinical features and obstetrical outcomes among the three groups

表2 3組胎盤印跡基因PHLDA2表達差異比較Tab 2 The expression of PHLDA2 in placenta among the three groups

子癇前期PHLDA2啟動子甲基化的表達改變用焦磷酸甲基化測序的方法檢測發(fā)現(xiàn)，各組之間的胎盤組織中PHLDA2啟動子區(qū)甲基化程度差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.000），由高到低依次為早發(fā)型、晚發(fā)型、對照組（表3）。

討論本研究檢測了子癇前期組和正常對照組胎盤組織中PHLDA2基因表達和啟動子區(qū)甲基化情況，結果顯示子癇前期組胎盤組織中PHLDA2 mRNA表達降低，而啟動子區(qū)呈高甲基化表達狀態(tài)。這一結果在子癇前期的研究中為首次報道。

子癇前期的發(fā)病率約為7%～10%［5-6］，占孕產(chǎn)婦死亡的 9.2%［5，7］，影響圍產(chǎn)兒結局和遠期預后［8］，其中早發(fā)型子癇前期發(fā)生胎盤組織病變比晚發(fā)型更常見，易導致更嚴重的母體及胎兒并發(fā)癥［9-10］，因此需要更積極的臨床干預。本研究中早發(fā)型患者分娩孕周較晚發(fā)型和正常對照產(chǎn)婦平均提前了約3周，且均接受了剖宮產(chǎn)終止妊娠，分娩孕周的提前導致了新生兒出生體重較低，發(fā)生1 min低Apgar評分較多，這些結局與早發(fā)型子癇前期的病情出現(xiàn)更早、母兒并發(fā)癥更嚴重相關。

表3 3組中PHLDA2啟動子區(qū)甲基化情況比較Tab 3 The methylation statue in promoter region of PHLDA2 among three groups

子癇前期胎盤娩出后臨床癥狀和體征可自然消退，因此被認為是與胎盤密切相關的疾病，并且可能是一種與母系表達的印跡基因異常的疾病［11］。從表觀遺傳學角度探討印跡基因對滋養(yǎng)細胞侵襲行為的調控分子機制與印跡基因中胞嘧啶甲基化尤其是Cp G島的甲基化密切相關［12］。本研究中子癇前期孕婦PHLDA2啟動子區(qū)呈高甲基化表達，提示表觀遺傳的改變可能是導致胎盤內PHLDA2 mRNA的表達抑制的原因，從而導致子癇前期的發(fā)生和發(fā)展。印跡基因異常表達所導致的妊娠期并發(fā)癥往往還與胎盤功能異常有關，動物實驗發(fā)現(xiàn)PHLDA2基因表達與胎兒及胎盤重量呈負相關［13-14］，限制胎盤糖原累積［14］。對人類胎盤的研究中發(fā)現(xiàn)，高表達PHLDA2可導致滋養(yǎng)細胞功能下降，使胎盤功能受限，進一步導致FGR、早產(chǎn)、流產(chǎn)等妊娠并發(fā)癥［1，3］。低表達PHLDA2 可導致出生體重增加和胎盤肥大［15］。本研究結果中PHLDA2 mRNA在胎盤內的表達減少與既往FGR的研究結果相反，提示晚發(fā)型子癇前期胎盤PHLDA2表達較少，也可能是缺氧導致滋養(yǎng)細胞侵襲力降低后的反向保護作用。

綜上，本研究觀察到印跡基因PHLDA2在子癇前期胎盤內的表達差異和表觀遺傳學改變，初步了解基因的低表達和啟動子區(qū)Cp G島高甲基化與子癇前期的關系，為子癇前期分子機制提供了依據(jù)。

作者貢獻聲明朱好 論文設計，數(shù)據(jù)采集和統(tǒng)計分析，論文撰寫和修訂。胡蓉 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，修訂論文。顧蔚蓉 論文構思和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。