外源性催產素對shank3缺陷斑馬魚成魚社交行為的影響

王 怡 劉春雪 胡純純 徐 秀

（復旦大學附屬兒科醫院兒童保健科 上海 201102）

孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）是一類神經發育障礙性疾病，社交溝通障礙是其核心癥狀之一［1］。ASD至今尚缺乏特效治療方法，癥狀往往伴隨患者一生，致殘率高。ASD的病因十分復雜，研究表明遺傳因素在ASD發病中占主導作用［2-4］。基因的變異（包括染色體重排、拷貝數變異和編碼區序列變異）被認為是與ASD遺傳因素相關的主要原因［5］，突觸功能障礙可能是常見的發病機制［6］。越來越多的證據表明，shank3基因的缺陷與ASD之間具有強烈的因果關系［7-8］。研究顯示，shank3基因缺陷是ASD最常見的單基因遺傳原因之一［9］。作為突觸蛋白中的主要支架蛋白，SHANK 3蛋白位于興奮性突觸的突觸后致密區，對突觸的正常發育和功能行使至關重要［10］。

一直以來，shank3基因缺陷患者的治療是研究熱點和難點，傳統的治療手段主要以行為干預訓練及教育指導為主，但效果欠佳。近年來，越來越多的研究者致力于探索利用催產素治療ASD患者的社交缺陷。哺乳動物催產素是一類主要由下丘腦室旁核和視上核合成分泌的神經肽［11］，大部分釋放到外周血，對機體的生理功能進行調節。部分內源性催產素經神經元纖維投射到下丘腦等中央或邊緣神經系統，通過結合膜表面的催產素受體（oxytocin receptor，OXTR）激活胞內G蛋白偶聯受體信號通路［12］，調節不同的神經回路，進而影響行為的輸出。催產素可以通過加強社會記憶、增加社會獎賞機制以及調節社交注意來調節哺乳動物的社交認知和社交行為［13-15］。2015 年，Penagarikano等［16］發現連續2周對ASD相關基因cntnap2小鼠模型進行外源性催產素給藥（P7～P21），cntnap2小鼠社交行為缺陷的改善持續到P30。這項研究為單基因缺陷相關ASD的藥物研究提供了一個新方向。

目前藥物的開發和研究主要集中在體外篩選，雖然也能成功篩選到藥物，但難以通過體內驗證，因此無法創建整個生物體的復雜網絡聯系。這些局限性在精神和神經類藥物中尤為突出和嚴重，因為大腦活動無法在體外模擬和重塑［17-19］。近年來，斑馬魚被廣泛應用于神經發育障礙性疾病的分子遺傳學和藥物治療研究［20-21］。研究人員已經建立公認且成熟的斑馬魚行為學（社交、刻板行為、認知等）檢測系統［20］，因此可以構建ASD斑馬魚模型，并通過成熟的行為學檢測系統量化藥物治療后的行為學指標，判斷是否改善ASD樣行為，從而評估藥物療效。

2019 年，Sgritta等［22］報道催產素單劑量治療shank3b-/-小鼠模型，其社交偏好缺陷和社交互動能力得到短暫的改善。但尚無研究報道催產素長期治療shank3缺陷動物模型的社交行為缺陷。本課題組在前期工作中已成功構建了shank3ab-/-斑馬魚品系。行為學檢測提示，相比于野生型斑馬魚，shank3ab-/-斑馬魚表現出明顯的集群能力降低、社交偏好性降低以及重復、刻板游動增加等孤獨癥樣表型［23］。催產素是一類高度保守的神經多肽［24］，斑馬魚體內的硬骨魚催產素-垂體后葉激素運載蛋白與其他物種催產素前體的氨基酸序列高度相似［25］。本研究利用已構建成功的shank3ab-/-斑馬魚模型，進行多種形式的外源性催產素干預實驗，觀察是否改善ASD的核心癥狀，為今后催產素應用于臨床治療shank3基因缺陷的ASD患者提供實驗基礎。

材料和方法

實驗動物shank3ab-/-斑馬魚（Tu品系）模型由本課題組的劉春雪博士構建［23］。標準條件飼養野生型（wild-type，WT）斑馬魚和shank3ab-/-斑馬魚：魚房恒溫28.5℃，采用與斑馬魚睡眠節律相一致的模擬晝夜交替燈光，即每天14 h（早7點到晚21點）的光照環境和10 h（晚21點到早7點）的黑暗環境。

藥物配制及給藥處理催產素多肽序列：NH2-Gly-Leu-Pro-Cys-Asn-Gln-lle-Tyr-Cys-OH。將催產素（CAS no.50-56-6，英國TOCRIS公司）用無菌水溶解到1 mmol/L儲備溶液中，配成催產素原液。實驗開始前，將催產素原液用生理鹽水稀釋成5 nmol/L 工作液［26］。選取 4.5 mpf的斑馬魚雄魚進行隨機分組：WT-sal組，WT注射生理鹽水；WTOXT組，WT注射催產素；shank3ab-/--sal組，shank3ab-/-注射生理鹽水；shank3ab-/--OXT組，shank3ab-/-注射催產素。分別進行3種療程的給藥處理：單次、短期及長期。

實時熒光定量PCR 選取受精后第7天（7 dpf）、受精后第 1 個月（1 mpf、3.5 mpf、4.5 mpf）的WT斑馬魚和shank3ab-/-斑馬魚，收集單次注射催產素并結束行為學實驗的WT-sal組、WT-OXT組、shank3ab-/--sal組和shank3ab-/--OXT組斑馬魚，用RNA提取試劑盒（日本Takara公司）提取全腦總RNA，37℃連接15 min，逆轉錄PCR（85℃、5 s）后得到cDNA，實時熒光定量PCR（95℃變性30 s，循環40次，95℃、30 s，60℃、30 s擴增）檢測斑馬魚腦內oxtr的mRNA水平（表1）。

表1 實時熒光定量PCR的引物序列Tab 1 Primer sequence of real-time q-PCR

行為學檢測行為學實驗均在溫度恒定（28.5℃）的行為房中進行。2019年5月開始實驗，2019年10月結束實驗，實驗時段在上午8∶30到下午3∶30。利用本院斑馬魚平臺的斑馬魚行為檢測和行為學分析系統（viewpoint）輸出原始數據（25幀/s），再進行數據分析。

1vs.6社交偏好實驗（圖1）：用透明插板將實驗缸（21 cm×10 cm×7.5 cm）平均分成右側的伙伴區域以及左側的實驗區域兩部分。伙伴區域放入6條代表正常伙伴的WT斑馬魚，實驗區域放入1條待測的實驗魚，適應15 min后進行30 min的行為學實驗錄制。數據分析時將實驗區域再平均分為伙伴側（社交區）以及空白區（非社交區）。WT斑馬魚傾向于緊貼伙伴魚側（社交區）游動，在伙伴側游動的距離和總游動距離的比值越接近1，表示社交傾向性越強。計算公式：社交區游動距離的百分比=［社交區游動距離/（社交區游動距離+非社交區游動距離）］×100%。

圖1 1 vs.6社交偏好實驗示意圖Fig 1 Sketch map of 1 vs.6 social preference test

實驗方案單次給藥：尾鰭注射催產素或生理鹽水15 min后，進行1 vs.6社交偏好性實驗。短期療程給藥：連續7天尾鰭注射催產素或生理鹽水，每天一次，第8天（距上一次注射12 h）進行1 vs.6社交偏好性實驗。長期療程給藥：連續14天尾鰭肌肉注射催產素或生理鹽水，每天一次，結束注射后1個月即第45天（距上一次注射1個月）進行1 vs.6社交偏好性實驗（圖2）。

圖2 斑馬魚給藥方案示意圖Fig 2 The administration schemeof zebrafish

統計學處理所有數據均以x±s表示，使用GraphPad Prism 6軟件分析和制圖。采用單因素方差分析統計社交偏好性實驗的數據，然后進行LSD多重比較檢驗（WT-sal組和shank3ab-/--sal組，shank3ab-/--sal組和shank3ab-/--OXT組，WT-sal組和WT-OXT組）。單劑量注射后檢測斑馬魚腦內oxtr表達，采用單因素方差分析，然后進行LSD多重比較檢驗。在不同發育階段，采用成組t檢驗分析WT斑馬魚和shank3ab-/-斑馬魚腦部oxtr的mRNA表達水平。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

外源性催產素單次給藥可改善shank3ab-/-斑馬魚的社交缺陷行為在1 vs.6社交偏好性實驗中，WT-sal組的伙伴側游動距離比為0.98，shank3 ab-/--sal組為0.86，后者在伙伴側游動的距離比顯著下降（0.98±0.015 vs.0.86±0.042，P=0.009），提示shank3ab-/-斑馬魚表現出明顯的社交缺陷行為。當給予單次催產素藥物干預后15～30 min內，shank3ab-/--sal組在伙伴側游動距離比為0.86，shank3ab-/--OXT組則為0.96，后者在伙伴側游動的距離比顯著升高（0.96±0.015 vs.0.86±0.042，P=0.013），社交傾向性明顯提高（圖3A）。而WT-sal組（0.98±0.015）和 WT-OXT組（0.99±0.004）在伙伴側游動距離比的差異無統計學意義，表明催產素能改善shank3ab-/-斑馬魚的孤獨癥社交缺陷表型，但并不影響野生型斑馬魚成魚的正常社交行為。

單次催產素藥物干預后15～45 min內，WT-sal組在伙伴側游動距離比均值為0.96，shank3ab-/--sal組均值為0.87，后者社交性顯著下降（0.96±0.016 vs.0.87±0.033，P=0.007），有明顯的社交缺陷行為。shank3ab-/-催產素組均值為0.91，相較于shank3 ab-/-生理鹽水組，催產素治療組的社交傾向性有升高趨勢（0.87±0.033 vs.0.91±0.019，P=0.193），但差異無統計學意義（圖3B）。WT生理鹽水組（0.96±0.016）和WT催產素組（0.97± 0.016）的伙伴側游動距離比差異無統計學意義。以上數據表明外源性催產素單劑量治療即時改善了shank3 ab-/-斑馬魚異常的社交偏好行為。

外源性催產素短期療程給藥可短期改善shank3ab-/-斑馬魚的社交缺陷行為為了增加催產素在斑馬魚體內的濃度，我們連續7天給予斑馬魚成魚外源性催產素進行周期性治療，第8天社交偏好性實驗發現，shank3ab-/--OXT組伙伴側游動的距離比均值為0.94，相較于對照的shank3ab-/--sal組（均值0.88），shank3ab-/--OXT組在伙伴側游動的距離比升高，社交傾向性差異有統計學意義（0.88±0.018 vs.0.94±0.015，P=0.006）。 WT-sal組（0.97±0.007）和 WT-OXT組（0.97±0.016）的伙伴側游動距離比組間差異無統計學意義。因此，外源性催產素短期療程干預治療能短期改善shank3缺陷斑馬魚的社交偏好缺陷（圖4）。

外源性催產素長期療程干預治療不能長期改善shank3ab-/-異常的社交缺陷行為給予斑馬魚成魚連續14天催產素治療，1個月后（Day45）進行社交偏好性實驗，shank3ab-/--OXT組（均值0.89）相較shank3ab-/--sal組（均值0.93）有傾向于伙伴側游動的趨勢，但差異無統計學意義（0.89±0.031 vs.0.93±0.020，P=0.213，圖 5）。因此，外源性催產素長期療程治療不能長期改善shank3缺陷斑馬魚異常的社交偏好性行為。

圖3 在社交偏好實驗中外源性催產素單劑量治療shank3ab-/-斑馬魚的結果Fig 3 Effects of social preference test on shank3ab-/-zebrafish under acute exogenousoxytocin exposure

圖4 在社交偏好實驗中外源性催產素短期療程治療shank3ab-/-斑馬魚的結果Fig 4 Effects of short-term exposure for exogenous oxytocin on shank3ab-/-zebrafish in social preference test

催產素干預shank3ab-/-斑馬魚的oxtr基因表達為了分析外源性催產素治療能夠改善shank3ab-/-斑馬魚社交偏好缺陷的機制，我們通過熒光定量PCR實驗檢測斑馬魚腦組織中oxtr基因的mRNA水平。

首先，檢測斑馬魚腦組織中oxtr在不同時間點的表達水平。WT斑馬魚和shank3ab-/-斑馬魚在7 dpf、1 mpf、3.5 mpf以及 4.5 mpf這 4 個典型的發育時間段，oxtr轉錄表達水平呈逐漸上升趨勢，且兩組間表達水平差異無統計學意義（圖6A）。

圖5 在社交偏好實驗中外源性催產素長期療程治療shank3ab-/-斑馬魚的結果Fig 5 Effects of long-term exposure for exogenous oxytocin on shank3ab-/-zebrafish in social preference test

其次，檢測催產素單次治療組和生理鹽水組的WT及shank3ab-/-（均為4.5 mpf）斑馬魚成魚腦組織內oxtr基因mRNA即時水平，結果顯示：相對于WT-sal組，WT-OXT組的oxtr基因mRNA水平顯著升高（P＜0.001），而shank3ab-/--OXT干預組相對shank3ab-/--sal組有升高趨勢，但差異無統計學意義（圖6B）。綜上所述，外源性催產素干預會引起斑馬魚oxtr基因mRNA水平的即時上升。

討 論

圖6 單劑量外源性催產素干預后斑馬魚腦內oxtr基因mRNA水平的比較Fig 6 Comparison of relative mRNA expression of oxtr gene in the brain of zebrafish after acute oxytocin exposure

本研究表明外源性催產素治療能夠改善shank3缺陷動物模型的異常社交偏好性行為，社交缺陷改善的持續時間與給藥周期相關。本研究首次發現長期療程的外源性催產素治療對shank3ab-/-斑馬魚成魚的社交缺陷行為沒有長期影響，揭示了oxtr在shank3ab-/-斑馬魚腦內的時間表達分布，為今后深入研究催產素治療shank3缺陷動物模型提供了實驗基礎。

本研究發現外源性催產素單劑量治療能夠即時改善shank3ab-/-斑馬魚異常的社交偏好性行為。外源性催產素可以通過血腦屏障，到達中樞神經系統。催產素治療社交缺陷的問題之一是半衰期短，催產素在哺乳動物腦內的半衰期約為20 min［27］。因此單劑量給予shank3ab-/-斑馬魚魚鰭肌肉注射催產素后30 min內社交缺陷得到改善，注射后45 min時社交缺陷改善不明顯。我們推測通過血腦屏障進入中樞神經系統的部分外源性催產素，在注射后45 min時可以有效結合OXTR的催產素濃度已經急劇下降，進而不能對社交行為產生改善。

為了提高催產素在腦內的濃度，本研究對shank3ab-/-斑馬魚進行了持續7天的短期催產素干預后，其社交偏好性行為改善效應延長到給藥后12 h，較單劑量注射的改善時長明顯增加。然而，持續14天的長期療程結果顯示，長期療程給藥并不能明顯改善shank3ab-/-斑馬魚的社交缺陷。我們推測，催產素療效所致社交偏好缺陷的改善可能隨著藥物代謝而結束，因而在成年shank3ab-/-斑馬魚上無法觀察到遠期療效。

催產素的親社會影響主要通過OXTR介導［28］，本研究檢測了7 dpf（幼魚期）、1 mpf（青少年期）、3.5 mpf（成年早期）以及4.5 mpf（成年期）等4個發育時期WT以及shank3ab-/-斑馬魚腦內oxtr的mRNA水平，發現兩者之間無任何差異。我們推測shank3缺陷斑馬魚腦內OXTR未出現異常，因而能與外源性催產素有效結合，進而影響社交缺陷的改善。單劑量催產素干預后，shank3ab-/-斑馬魚腦內oxtr的mRNA水平雖有上升趨勢，但差異無統計學意義，而催產素干預后WT斑馬魚腦內oxtr的mRNA水平有顯著變化，差異有統計學意義，這兩者的差異還需進一步研究。

最新研究表明Shank3缺陷影響穩態可塑性，穩態可塑性作為神經可塑性的主要形式之一，外界環境變化時神經系統維持在一定范圍內活動，從而維持腦功能相對于外界環境變化時的穩定［29］。下丘腦分泌的神經肽催產素是介導跨感知覺模態可塑性的關鍵分子，觸覺剝奪后的小鼠給予催產素改善初級軀體感覺皮層可塑性的同時，也改善了初級視覺皮層的發育，繼而維持感知覺神經網絡的穩定性［30］。shank3基因缺陷人群有嚴重的感知覺異常［31］。靶向敲除外周軀體感覺神經元shank3基因的小鼠，除表現出嚴重的感知覺異常，也出現嚴重的社交缺陷，經藥物干預后均有所改善［32］。因此，我們推測催產素可能通過改善s hank3基因缺陷受損的感知覺穩態可塑性，從而改善shank3缺陷斑馬魚的社交缺陷。

本研究主要研究催產素干預成魚的療效，只檢測了oxtr基因的mRNA水平，對其他的可能分子機制未進行分析。后期研究可針對斑馬魚發育早期（即神經發育早期）進行外源性催產素的藥物干預，以期獲得更顯著的改善作用和遠期療效。

作者貢獻聲明王怡 研究構思，數據采集，論文撰寫和修訂。劉春雪 論文修訂，構建模型。胡純純，徐秀 論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。