整合調控網絡分析篩選骨髓增生異常綜合征ABAT基因相關長鏈非編碼RNA SET2-1及其對細胞增殖和凋亡的影響

王 倩 王小欽 陳燕珍 趙光杰 吳宛玲 李念夷△

（1復旦大學附屬華山醫院血液科，2國際醫療中心 上海 200040）

骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，MDS）是一組造血干/祖細胞克隆性疾病，表現為髓系發育不良，血細胞減少，并有進展為急性髓系白血病的風險［1］。對MDS發生的分子機制認識至今仍十分有限，阻礙了MDS治療的進展［2］。近年來表觀遺傳學改變在MDS發生中的作用日益受到重視。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）是一類由RNA聚合酶Ⅱ合成、長度大于200個核苷酸、沒有長閱讀框架的RNA［3］。功能研究表明LncRNA在表觀遺傳學水平對細胞生命活動發揮著重要的調控作用［4］。雖然目前已有研究表明 HOXB-AS3［5］、XIST［6］、MEG3［7］等LncRNA與MDS有關，但相對LncRNA眾多的基因數量和在高等真核生物復雜調控網絡中的重要作用，仍有大量可能參與MDS病理過程的LncRNA未被發現。我們在前期研究中發現ABAT基因在MDS患者中具有高甲基化低表達的特點，ABAT的異常表達與MDS的不良預后有關，且可影響MDS轉白細胞系的增殖和凋亡［8-9］，但對于調控ABAT的上游分子仍不明確。近年來的研究表明，通過對多種高通量分析方法得到的數據進行整合分析，相比只對單一芯片數據進行分析更加有助于揭示腫瘤發生過程中復雜的生物調控過程［10-11］。因此，本研究中我們將MDS患者與對照者骨髓標本的 DEGs、DEMs、DELs進行整合分析，構建具有MDS特征的調控網絡，從中篩選出調控ABAT的LncRNA，并對其在MDS中的功能進行初步研究。本研究有助于進一步了解LncRNA在MDS發生過程中的作用，以期為MDS的治療提供新的策略和靶點。

資料和方法

標本來源LncRNA檢測選擇2015年1月1日至2016年12月30日復旦大學附屬華山醫院血液科收治的23例MDS患者，其中男性15例、女性8例，平均年齡65歲（29～82歲）；作為對照的7例非造血腫瘤患者（如缺鐵性貧血、免疫性血小板減少癥、脾功能亢進癥等）平均年齡38歲（23～78歲），兩組性別分布差異無統計學意義。芯片檢測病例組為4例MDS患者，其中 2例分型為 RAEB-1（refractory anemia with excess blasts 1），2例為 RAEB-2，男性 3例、女性1例，平均年齡67歲（24～80歲）；另以年齡（±5歲）、性別匹配，選擇同期行骨髓穿刺檢查的4例非造血腫瘤患者作為對照組。所有患者采集骨髓標本時均為初次診斷、未接受化療、排除MDS/骨髓增殖性疾病（myeloproliferative neoplasms，MPN）及MDS轉白患者。采集骨髓標本2～3 mL后，均使用Ficoll淋巴細胞分離液（美國GE公司）密度梯度離心法獲得骨髓單個核細胞（bone marrow mononuclear cells，BMMNCs）。MDS 診斷及分型均按照2016年版WHO淋巴造血系統腫瘤分類標準［1］。本研究經復旦大學附屬華山醫院倫理委員會批準（批準號：2015-269），患者均簽署了臨床研究知情同意書。

細胞系人急性白血病細胞系THP-1購自中國科學院（上海），人MDS轉白急性白血病細胞系SKM-1購自日本細胞庫（the Japanese Collection of Research Bioresources，LCRB）。作為對照的 HEK-293T細胞系購自中國科學院（上海）。所有細胞系均在RPMI-1640培養基（Hyclone，美國GE公司）中培養，添加 10% 胎牛血清（Gibco-BRL，美國Thermo Fisher Scientific公司），置于5%CO2，37℃培養箱，每2天換液1次。

芯片分析通過血液基因組DNA和RNA提取試劑盒（美國Qiagen公司）對4例MDS患者和4例對照患者的骨髓標本提取基因組DNA和RNA。采用Infinium Human Methylation 450K Bead Chips甲基化芯片和Agilent human genomewide gene expression 60K Bead Chips表達譜基因芯片（上海歐易生物科技有限公司）檢測。60K Bead Chip人類全基因組表達芯片（Agilent）中共包含27 958個Entrez Gene RNA和7 419個LncRNA。芯片掃讀后會獲得原始信號值、標準化信號值以及檢出情況，對所有樣本進行主成分分析（principal component analysis，PCA），考察樣品的分布情況，確定重復樣品的均一性，之后根據芯片確認單中提供的分析方法進行數據比對。分位數歸一化和隨后的數據處理通過Genespring軟件（版本12.0，美國Agilent Technologies公司）完成。之后對原始數據進行篩選，表達量在兩組間表達差異超過2倍，Student"s t檢驗P＜0.01被認為存在差異表達。

為了構建MDS相關的調控網絡，我們采用一種基于LncRNA-微RNA（microRNA，miRNA）靶向方法來預測LncRNA的潛在靶標。首先，對每種DELs，通過 miRcode數據庫［12］獲得潛在的 miRNA產物。之后在數據庫miRbase v21、mirTarbase、miRanda 2010、miRbase v18、Tarbase5.0、targetscan v6.2中預測miRNA的潛在靶標，過濾掉了少于3個數據庫注釋的基因。將剩余的基因與芯片篩選出的差異表達基因組進一步比較。然后使用chip Base數據庫分析LncRNA的轉錄因子，進一步分析轉錄因子與差異基因，利用此種方法構建了MDS相關的LncRNA-miRNA-DEGs-轉錄因子（transcription factors，TFs）調控網絡。

基于LncRNA-TFs-DEGs調控網絡篩選ABAT基因的調控LncRNA 采用Pearson相關系數（PCC）評估來構建ABAT與相關LncRNA的共表達調控網絡。通過計算絕對PCC，取P值≤0.01，PCC倍數＞0.99作為閾值，建立ABAT基因和DELs的共表達網絡模型。我們通過計算PCC和P值來評估LncRNA-信使RNA（messenger RNA，mRNA）的相關性。用Cytoscape software 3.2.0（美國The Cytoscape Consortium公司）繪制ABATDELs-DEGs共表達網絡。

qRT-PCR法檢測LncRNA-SET2-1和ABAT的表達用 Trizol（Invitrogen，美國 Thermo Fisher Scientific公司）抽提骨髓標本及培養細胞的總RNA，用Takara PrimeScript RT Master Mix試劑盒（日本Takara公司）將RNA反轉錄為cDNA。使用Applied Biosystems?7500 Real-Time PCR system（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行qRT-PCR擴增，反應體系為20μL，冰上加入反轉錄產物2μL，每條引物0.4μL（10μmol/L），SYBR?Premix Ex Taq?（日本Takara公司）10μL，ROX Reference DyeⅡ（日本Takara公司）0.4μL，雙蒸水6.8μL。反應條件：95℃反應30 s預變性，95℃反應5 s，60℃反應34 s，共40個循環。引物序列如下，LncRNA-SET 2-1，Forward：5"-TCGCCGGAGTCATATTATCG-3"，Reverse：5"-CAGCAGCAGGAAGAGCAGTT-3"；ABAT，Forward：5"-CCGACTACAGCATCCTCTCC-3"，Reverse：5"-GGTTCTCTTTCACAAACTCTTCC-3"；GAPDH，Forward：5"-GACCTGACCTGCCGT-CTA-3"，Reverse：5"-AGGAGTGGGTGTCGCTG-T-3"。 采 用 2-ΔΔCT方法計算LncRNA-SET 2-1和ABAT表達水平，以GAPDH為內參，每組取3個復孔均值，根據各樣本的平均CT值，以2-ΔΔCT表示目的基因表達水平，LncRNA-SET 2-1 或 ABAT 相 對 表 達 量 =2-ΔΔCT（LncRNA-SET 2-1或ABAT）-2-ΔΔCT（GAPDH）。

構建LncRNA-SET2-1過表達慢病毒載體和穩定轉染的細胞系按照分子克隆技術指南［13］構建含有LncRNA-SET 2-1過表達片段的GV 470慢病毒載體（上海吉凱基因醫學科技股份有限公司）。取對數生長期的SKM-1細胞和THP-1細胞，按1×106/mL接種于6孔板，過夜后將LncRNA-SET 2-1過表達的慢病毒載體和對照空載體分別轉染SKM-1細胞和THP-1細胞。由于慢病毒載體帶有綠色熒光蛋白序列，轉染后72 h通過使用流式細胞儀檢測綠色熒光蛋白強度來評估細胞轉染效率，陽性細胞比例大于80%。之后，在SKM-1細胞和THP-1細胞的培養基中分別加入1μg/mL、2μg/mL的嘌呤霉素。培養2周后獲得穩定轉染帶有嘌呤霉素抗性慢病毒載體的細胞系。繼續培養4天后，應用qRTPCR檢測穩定轉染細胞系中LncRNA-SET 2-1的表達水平。

CCK-8法檢測細胞增殖活力使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒檢測細胞增殖活力。將穩定過表達LncRNA-SET 2-1的SKM-1細胞、THP-1細胞和轉染空載體的對照細胞，按1×103/孔接種于96孔板，每組設3個復孔，培養5天，每3天更換一次細胞培養液。分別培養至24 h、48 h、72 h、96 h時，每孔加入5μL CCK-8試劑，繼續培養4 h后分光光度計上測量各孔450 nm處吸光度值（D），計算細胞增殖指數。

流式細胞術檢測細胞凋亡將穩定過表達LncRNA-SET 2-1的SKM-1細胞、THP-1細胞和轉染空載體的對照細胞按1×106/mL接種于6孔板，培養48 h后收集細胞，PBS洗2次后加入200μL結合緩沖液重懸細胞，加入5μL Annexin V-APC和5μL 7-AAD（美國Thermo Fisher Scientific公司）混勻，避光室溫孵育15 min。流式細胞儀（BD Accuri C6，美國BD Biosciences公司）檢測細胞凋亡率，使用Flowjo 7.6軟件進行數據統計分析。每次實驗重復3次。

統計學處理應用SPSS 25.0軟件處理數據。符合正態分布的計量資料用x±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

芯片整合分析MDS患者相對對照者的BMMNCs，應用表達譜基因芯片共篩選出1 937個DEGs，其中853個基因表達上調，1 084個基因表達下調；篩選出214個DELs，其中102個LncRNA表達上調，112個LncRNA表達下調。應用甲基化基因芯片篩選出515個DEMs，其中高甲基化基因304個，低甲基化基因211個。對篩選出的DEGs、DELs、DEMs進行整合分析，構建 MDS的LncRNA-miRNA-DEGs-TFs調控網絡（圖 1）。該調控網絡包括：LncRNA-TFs-DEGs調控網絡，TFs-miRNA-LncRNA調控網絡，miRNA-DEGs-DEMs調控網絡。GO（Gene ontology）分析差異表達基因參與的生物學過程，前10位GO富集的生物學過程包括：細胞內級聯信號，凋亡調控，磷酸代謝過程，免疫反應，防御反應，細胞增殖調控，生物合成過程正向調控，磷酸化過程，通過RNA聚合酶II啟動子的轉錄調控，生物黏附。

圖1 MDS整合調控網絡Fig 1 The integrated regulatory network of MDS

基于LncRNA-TFs-DEGs調控網絡篩選ABAT基因的調控LncRNA 在前期的研究中，我們篩選出6個高甲基化低表達的基因（ABAT，DAPPI，FADD，LRRFIPI，PLBDI，SMPD3）并建立了 MDS的CpG島甲基化表型，可能成為MDS診斷的潛在分子生物學標志［8］。本研究對以上6個基因進行了深入的信號通路整合分析，僅4個基因（ABAT，DAPP1，FADD和SMPD3）有功能信號通路。我們在前期研究中發現，ABAT基因異常低表達與MDS的不良預后有關，下調其表達水平可促進髓系腫瘤細胞系的增殖能力、抑制細胞凋亡，提示ABAT可能參與MDS的發生過程［9］。因此，我們在構建的MDS調控網絡中，對ABAT參與的LncRNA-mRNA調控網絡進一步分析。通過建立ABATDELs-DEGs共表達網絡，我們發現了6個與ABAT共表達且相關性最強的DELs。根據PCC對這6個LncRNA進行排序發現，LncRNA-SET 2-1與ABAT變化趨勢的PCC最高（表1）。利用UCSC數據庫（http：//genome.ucsc.edu）檢索發現，LncRNASET 2-1位于人類基因組6號染色體，為反義RNA，包括3個外顯子，長度約385bp。對其進行PhyloCSF評分，確定其為非編碼RNA。經DELs-DEGs共表達網絡分析發現，LncRNA-SET 2-1與ABAT、NCF2、SPTLC2、QPRT基因共表達。進一步通過LncRNA-miRNA-DEGs-TFs調控網絡分析和數據庫信息的匹配，預測到LncRNA-SET 2-1可能為miRNA 96的前體，而ABAT可能為miRNA 96的靶分子。根據以上生物信息學分析，LncRNA-SET 2-1可能對ABAT具有調控作用，且參與了MDS發展過程。因此，我們進一步研究LncRNA-SET 2-1在MDS患者及細胞系中的表達情況，及對MDS轉白細胞功能的影響。

表1 通過ABAT-DELs-DEGs共表達網絡發現的6個與ABAT基因共表達且相關性最強的DELsTab 1 Six DELs that are correlated with the ABAT gene based on the ABAT-DELs-DEGsco-expression network

LncRNA-SET2-1在MDS患者和MDS轉白細胞系中的表達情況MDS患者骨髓細胞中LncRNA-SET 2-1的相對表達量明顯低于對照組（1.63±0.96vs.5.55±1.69，P＜0.000 1），同時檢測ABAT基因在MDS患者骨髓細胞中的相對表達量也顯著低于對照組（0.33±0.12vs.0.93±0.25，P＜0.000 1）。在MDS轉白細胞系SKM-1和急性白血病細胞系THP-1中，LncRNA-SET 2-1的表達量顯著低于對照細胞HEK-293T（0.42±0.12vs.4.12±0.60，0.62±0.23vs.4.12±0.60，P＜0.000 1）（圖 2）。

圖2 LncRNA-SET2-1和ABAT在MDS患者和MDS轉白細胞系中的表達水平Fig 2 Expression levels of LncRNA-SET2-1 and ABAT in MDSpatients and cell lines

MDS轉白細胞系中LncRNA-SET2-1過表達對ABAT基因表達的影響穩定轉染LncRNA-SET 2-1過表達慢病毒載體的SKM-1細胞系和THP-1細胞系中，LncRNA-SET 2-1的相對表達量高于對照空載體組（9.65±1.24 vs.0.44±0.34，10.10±0.89 vs.0.38±0.21，P＜0.000 1）。穩定過表達 LncRNASET 2-1的SKM-1細胞和THP-1細胞中ABAT基因的相對表達量較對照組上調2倍（1.86±0.13 vs.0.91±0.02，1.79±0.21 vs.0.89±0.03，P＜0.01）。但我們對前期研究中構建的ABAT敲減SKM-1和THP-1細胞系［9］中 LncRNA-SET 2-1的相對表達水平進行檢測，與對照組相比未發生顯著改變（0.35±0.01 vs.0.39±0.01，0.47±0.03 vs.0.40±0.01，P＞0.05）（圖 3）。

圖3 LncRNA-SET2-1過表達對ABAT基因表達的影響Fig 3 Effect of LncRNA-SET2-1 overexpression on ABAT gene

MDS轉白細胞系中LncRNA-SET2-1過表達對細胞增殖和凋亡的影響穩定過表達LncRNASET 2-1的SKM-1細胞和THP-1細胞培養24 h后，與對照組相比，細胞增殖活力在72 h（D值分別為1.10±0.03 vs.1.47±0.02，0.75±0.02 vs.1.42±0.08，P＜0.001）、96 h（D 值分別為 1.61±0.09 vs.2.23±0.13，P＜0.001；1.25±0.08 vs.2.18±0.23，P＜0.05）均顯著下降（圖4）。流式細胞術檢測過表達LncRNA-SET 2-1的SKM-1細胞凋亡細胞比例顯著高于對照組（73.39%±2.78%vs.57.77%±2.36%，P=0.02），同樣，過表達 LncRNA-SET 2-1的 THP-1細胞凋亡細胞比例也顯著高于對照組（74.59%±3.07%vs.54.48%±2.19%，P=0.001）（圖 5）。說明LncRNA-SET 2-1過表達對MDS轉白細胞的增殖活力具有抑制作用，并促進MDS轉白細胞凋亡。

討 論

圖4 LncRNA-SET2-1過表達抑制MDS轉白細胞增殖活力Fig 4 LncRNA-SET2-1 overexpression reduced the viability of MDStransformed leukemia cell

圖5 LncRNA-SET2-1過表達促進MDS轉白細胞凋亡Fig 5 LncRNA-SET2-1 overexpression induced MDStransformed leukemia cell apoptosis

LncRNA作為人類細胞中大量存在的非編碼RNA，在信號轉導、細胞增殖分化、細胞周期、個體發育等重要生命活動中發揮關鍵的調控作用，涉及到表觀遺傳水平、轉錄水平以及轉錄后水平等多個層面的復雜調控［14］。目前，在多種類型腫瘤中都已發現存在LncRNA的失調，說明其與腫瘤的發展密切相關［15］。LncRNA在調控造血發育中也起到重要作用，其異常調控參與了造血腫瘤的發展，如AML，MPN，ALL等［16-17］。雖然目前已有 LncRNA與MDS發展有關的報道，但相比AML，對參與MDS病理過程的LncRNA認識仍十分有限。我們在前期研究中發現，ABAT基因在MDS中具有診斷和預后價值，并可影響MDS轉白細胞的增殖活力和凋亡。本研究中，我們基于基因芯片整合分析構建ABAT-DELs-DEGs共表達網絡，篩選出ABAT基因可能的調控LncRNA，并對該LncRNA在MDS患者和MDS轉白細胞中的表達情況及功能進行了初步研究。

高通量基因芯片是幫助發現MDS發生過程中新的調控分子的重要工具，但是，僅依靠單一的LncRNA芯片或者mRNA芯片，難以從海量的數據中篩選出有價值的信息。利用多種不同芯片進行生物信息學整合分析、構建分子調控網絡有助于揭示復雜的生物調控過程、篩選發現生物調控網絡中的關鍵分子［18］。本研究中，我們對MDS患者和對照者骨髓標本中的DEGs、DELs和DEMs進行整合分析，通過對DELs靶分子與結合轉錄因子的預測，與表達芯片篩出的DEGs進行對比分析，構建了MDS相關的LncRNA-miRNA-DEGs-TFs調控網絡。在該網絡的基礎上，我們尋找到可能作為LncRNA-SET 2-1剪切產物的miRNA 96，推測miRNA 96可能作為ABAT的轉錄因子對ABAT基因進行調控，提示可能存在LncRNA-SET 2-1-miRNA 96-ABAT調控軸。

我們首次在MDS患者骨髓標本和MDS轉白細胞系中檢測發現LncRNA-SET 2-1表達顯著下調，與同時檢測的ABAT基因表達變化趨勢一致。過表達LncRNA-SET 2-1后，ABAT基因表達上調，而下調ABAT表達，LncRNA-SET 2-1表達不受影響，提示LncRNA-SET 2-1可能為ABAT上游調控分子，且對ABAT具有正向調控作用。功能研究表明，LncRNA-SET 2-1過表達會抑制MDS轉白細胞增殖、促進細胞凋亡，說明在MDS中，LncRNASET 2-1異常下調可能對造血細胞腫瘤化具有一定作用。由于在MDS患者和MDS轉白細胞系中，LncRNA-SET 2-1與ABAT基因表達變化一致，對細胞表型影響一致，且LncRNA-SET 2-1可能為ABAT上游調控分子，結合芯片整合分析可能存在LncRNA-SET 2-1-miRNA 96-ABAT調控軸的結果，我們推測LncRNA-SET 2-1和ABAT可能存在競爭性內源 RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）的關系。ceRNA是LncRNA發揮生物學功能的9種主要方式之一，代表了一種全新的基因表達調控模式，相比miRNA調控網絡，涉及更多的RNA分子，更為精細和復雜，是目前腫瘤研究領域的一個熱點［19-21］。對 LncRNA-SET 2-1-miRNA 96-ABAT調控軸的研究可為我們從轉錄組水平深入探索MDS的發病機制提供一個新的視角。

本研究首次基于MDS患者骨髓標本不同基因芯片的整合分析，發現可能存在LncRNA-SET 2-1-miRNA 96-ABAT調控軸，并初步驗證了LncRNASET 2-1對ABAT基因具有正向調控作用，且LncRNA-SET 2-1表達失調可能參與了MDS的病理過程。由于本文僅對LncRNA-SET 2-1在MDS中的功能進行了初步探索，因此具有一定局限性，關于LncRNA-SET 2-1與ABAT之間具體調控方式和是否存在ceRNA的實驗正在進行中。本研究為從轉錄組水平深入探索MDS發生的分子機制提供了新的生物信息學分析方法，并提出了可能參與MDS發生的新的LncRNA及其作用方式，對LncRNA-SET 2-1-ABAT調控軸的深入研究將為認識MDS的病理機制提供新的方向。

作者貢獻聲明王倩 論文構思，數據采集，數據統計和分析，論文撰寫和修訂。王小欽 數據審核，論文修訂。陳燕珍 臨床樣本分析。趙光杰細胞轉染實驗。吳宛玲 細胞活性和凋亡實驗。李念夷 生物信息學分析，數據統計和分析，論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。