維替泊芬誘導子宮內膜癌細胞發生內質網應激及自噬相關蛋白表達

王 博 任曉俊 薛 譽 王 超△

（1復旦大學附屬婦產科醫院婦科 上海 200011；2上海市女性生殖內分泌相關疾病重點實驗室 上海 200011）

子宮內膜癌是常見的三大女性生殖系統腫瘤之一，其發病率逐年上升［1］。子宮內膜癌的發病機制一直是婦科腫瘤領域研究的熱點，但多數研究集中在子宮內膜癌PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活及胰島素抵抗的作用機制等方面［2-3］。而腫瘤的發生往往伴隨著癌基因突變，轉錄、翻譯過程異常，導致胞內蛋白質異常折疊并堆積，繼而發生內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ER stress）。內質網應激與子宮內膜癌細胞的凋亡、自噬等有密切聯系［4-6］。內質網應激標志蛋白葡萄糖調節蛋白78（GRP78，又名 BIP蛋白）和 C/EBP同源蛋白（CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）在子宮內膜癌患者中均明顯升高［7-9］，提示內質網應激在子宮內膜癌的發病機制中同樣重要。維替泊芬（verteporfin）是一種用于光動力療法（photodynamic therapy，PDT）的光敏劑，曾被證明是Hippo通路主要效應分子YAP的抑制劑，被廣泛應用于腫瘤抑制相關研究［10-11］。我們前期工作首次報道維替泊芬能明顯拮抗子宮內膜癌細胞生長［3］，在電鏡下觀察到維替泊芬誘導細胞內出現自噬小體［12］。已有文獻報道，內質網過度應激可誘導自噬小體產生，參與細胞的自噬和凋亡過程［13］。因此我們假設：維替泊芬通過誘導子宮內膜癌細胞發生內質網應激，促進細胞自噬和死亡，從而抑制子宮內膜癌。本研究重點驗證維替泊芬誘導子宮內膜癌細胞發生內質網應激的過程，為維替泊芬的臨床應用提供理論和實驗基礎。

資料和方法

細胞和試劑維替泊芬購自美國Sigma公司；IRE-1a、BIP、PDI、CHOP、YAP、Rab11抗體購自美國 Cell Signaling Technology（CST）公司；P53、βaction購自美國VWR International公司、Erk2抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；子宮內膜癌細胞株既往獲贈于美國安德森癌癥中心系統生物學Dr.Mills實驗室。根據前期研究工作［3］和文獻報道，實驗組中維替泊芬的濃度設定為0.1、0.15、0.3、1、2.5、3、5、10 μmol/L。

細胞培養選用前期研究工作中使用的4種人子宮內膜癌細胞株 KLE、EFE184、NOU-1和SKUT-2［2-3，12］。上述細胞均 培養于含有 5% 的胎牛血清中，分別用 DMEM/F12、RPMI1640、DMEM培養液進行培養，細胞放置在37℃、5%CO2培養箱中，取對數生長期細胞進行后續實驗。所有細胞系在分發前都通過了美國安德森癌癥中心細胞庫短串聯重復序列（short tandem repeat，STR）的鑒定，每個細胞系平均6個月重復鑒定STR。

細胞增殖能力測定取對數期生長的人子宮內膜癌細胞接種于96孔板上，每孔100μL，孵育24 h，待細胞貼壁后加入不同濃度的維替泊芬（0.15、2.5、3、5、10 μmol/L），分別培養不同時間（12、16、24 h），處理后的細胞于4℃下在96孔板中用10%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）固定1 h，去離子水洗滌并在室溫下風干。然后每孔加入1%乙酸溶液與0.4% 磺酰羅丹明B（sulforhodamine B，SRB），并在室溫下孵育30 min；然后用1%乙酸洗滌并在室溫下風干。使用100～200μL的10 mmol/L非緩沖Tris堿溶液（pH=10.5）溶解已結合的SRB。用自動酶標儀測量540～560 nm波長的吸光度值（D）。所有實驗均進行3次。

Western blot實驗收集處理后的細胞，使用4℃PBS洗滌2次，在RIPA裂解液（美國Santa Cruz Biotechnology公司）中裂解。將得到的懸浮液在4℃、14 000 r/min離心10 min（有效離心半徑為15 cm）。收集上清液，用試劑盒（美國Thermo Scientific公司）測定蛋白質濃度。將細胞裂解液與6×SDS樣品緩沖液在100℃孵育5 min，行SDSPAGE，轉移至膜上，用適當的一抗和二抗探測。通過增強型化學發光（enhanced chemilumine-scence，ECL）技術（美國GE Healthcare公司）檢測蛋白質條帶。

免疫熒光顯微鏡將細胞在4%多聚甲醛中固定10 min，在冰上用含有0.3%Triton X-100的PBS溶液滲透2 min。室溫下用1%牛血清白蛋白封閉1 h后，使用一抗（1∶1 000），4℃下細胞染色過夜。PBS洗滌3次，將細胞與適當的二抗（1∶2 500）在室溫下孵育1 h。PBS洗滌3次，將載玻片用抗褪色試劑、內質網應激示蹤劑（綠色）和DAPI（藍色）固定。

統計學分析通過雙側方差分析和Sidak多重比較檢驗得出統計顯著性（除非另有說明），通過在多個相關細胞系中重復研究來支持結果的準確性和通用性。對照標準化為1，除非另有說明，否則統計量代表3個獨立實驗的x±s，每個實驗重復3次。P＜0.05為差異具有統計學意義。

結 果

蛋白酶抑制劑MG132和硼替佐米對子宮內膜癌細胞形態學及增殖的影響使用文獻常用的蛋白酶抑制劑MG132和硼替佐米［14-17］處理子宮內膜癌細胞系KLE和EFE184。結果顯示，細胞出現腫脹，胞內空泡樣結構增多，隨著藥物處理時間的延長，細胞死亡增加，其中EFE184細胞變化更明顯（圖1A和1B）。細胞增殖實驗顯示，MG132處理KLE和EFE184細胞12 h和24 h后，細胞增殖活力下降（圖2A）。硼替佐米處理后，EFE184和KLE細胞增殖活力也下降，而且隨著藥物作用時間的增加，增殖活性下降越明顯（圖2B）。

維替泊芬對子宮內膜癌細胞形態學及增殖的影響在活細胞成像系統中每隔4 h連續觀察2種光敏劑維替泊芬（0.1μmol/L，12 h）和原卟啉（0.1μmol/L，12 h）對子宮內膜癌細胞EFE184形態的影響。發現維替泊芬同樣引起細胞發生類似蛋白酶抑制劑作用后的細胞形態學改變，即細胞出現腫脹，胞內空泡樣結構增多，隨著藥物處理時間的延長，細胞死亡增加。但原卟啉對細胞無此作用（圖3）。

蛋白酶抑制劑MG132和硼替佐米上調內膜癌細胞內質網應激相關蛋白表達Western blot實驗中，使用蛋白酶抑制劑MG132（10μmol/L）和硼替佐米（1μmol/L）作用KLE和EFE184細胞12 h后，鈣敏感伴侶蛋白BIP和C/EBP同源蛋白CHOP水平均增加（圖4A、4B）。隨著作用時間的增加，MG132引起細胞內BIP和CHOP蛋白進一步增加（圖4A），但硼替佐米無此作用。而且，當MG132僅作用6 h時，對 IRE-1a、BIP、PDI蛋白水平的影響不明顯（圖5A）。

維替泊芬對內膜癌細胞內質網應激相關蛋白的影響Western blot實驗中，使用維替泊芬（10μmol/L）作用6 h后，KLE和EFE184細胞系中肌醇酶蛋白IRE-1a減少，鈣敏感伴侶蛋白BIP增加，C/EBP同源蛋白CHOP水平未見增加，蛋白質二硫鍵異構酶 PDI降低，但 MG132（10 μmol/L）作用6 h后無類似作用（圖5A）。降低維替泊芬的濃度（3μmol/L），增加作用時間至24 h后，發現在4種子宮內膜癌細胞系中CHOP的水平均增高（圖5B）。

維替泊芬對內膜癌細胞內質網應激相關蛋白的影響呈濃度依賴性KLE和EFE184細胞系經不同濃度維替泊芬（0.15、2.5、5、10 μmol/L）處理 24 h后誘導內質網應激的作用與濃度有關。維替泊芬濃度越高，內質網應激相關蛋白肌醇酶IRE-1a和蛋白質二硫鍵異構酶（protein disulfide isomerase，PDI）降低越明顯（圖6A）。當維替泊芬濃度為0～5μmol/L時，隨著濃度升高，增強子結合蛋白同源蛋白CHOP顯影逐漸明顯，BIP蛋白質水平也隨之增加。而當維替泊芬增加至10μmol/L后，CHOP相對表達量下降，而BIP蛋白質相對水平仍增加。此外，還發現抑癌基因產物p53增加，抑癌通路效應蛋白（Yes-associated protein，YAP）減少（圖6B）。

圖1 蛋白酶抑制劑MG132和硼替佐米導致子宮內膜癌細胞系EFE184和KLE的形態學改變（光鏡）Fig 1 Proteasome inhibitors MG132 and bortezomib induced morphological changesin endometrial cancer cell lines EFE184 and KLE（light microscope）

硼替佐米和維替泊芬均促進子宮內膜癌細胞發生內質網應激使用硼替佐米（1μmol/L）和維替泊芬（3μmol/L）處理細胞24 h后，在細胞免疫熒光實驗中發現細胞質中出現綠色的內質網應激示蹤劑，提示細胞質內發生內質網應激（圖7A）。此外，維替泊芬作用后細胞質溶酶體生成增多，融合熒光圖像后發現內質網應激（綠色熒光）和溶酶體（紅色熒光）的定位重合（圖7B）。

維替泊芬促進子宮內膜癌細胞中溶酶體的形成維替泊芬（3μmol/L，24 h）處理后，子宮內膜癌細胞系EFE184、NOU-1、SKUT-2中膜循環關鍵蛋白Rab11水平降低（圖8A）；在細胞免疫熒光實驗中發現EFE184在3μmol/L維替泊芬處理12 h和24 h后發生了細胞核形態的皺縮（藍色熒光）以及溶酶體的生成增多（紅色熒光，圖8B）。

討 論

圖2 蛋白酶抑制劑MG132和硼替佐米抑制子宮內膜癌細胞系KLE和EFE184增殖Fig 2 Proteasome inhibitors MG132 and bortezomib inhibited the proliferation of endometrial cancer cell lines KLE and EFE184

圖3 光敏劑維替泊芬和原卟啉作用下子宮內膜癌細胞系EFE184的形態學改變Fig 3 Morphological changes of endometrial carcinoma cell line EFE184 under the treatment of photosensitizers verteporfin and protoporphyrin

圖4 蛋白酶體抑制劑MG132和硼替佐米對子宮內膜癌細胞系KLE和EFE184內質網應激相關蛋白表達的影響Fig 4 Effect of proteasome inhibitors MG132 and bortezomib on the expression of ER stress-related proteins in endometrial cancer cells KLE and EFE184

圖5 維替泊芬改變4種子宮內膜癌細胞系中內質網應激相關蛋白表達Fig 5 Verteporfin affected expression of ER stress-related proteins in 4 types of endometrial cancer cells

圖6 維替泊芬誘導子宮內膜癌細胞系KLE和EFE184內質網應激具有濃度依賴性Fig 6 Verteporfin induced ER stressin endometrial cancer cell lines KLE and EFE184 in a concentration dependent manner

圖7 硼替佐米和維替泊芬誘導子宮內膜癌細胞系EFE184內質網應激和溶酶體生成Fig 7 Bortezomib and verteporfin induced ER stress and lysosomes formation in endometrial cancer cell line EFE184

圖8 維替泊芬誘導子宮內膜癌細胞內溶酶體形成Fig 8 Verteporfin induced the formation of lysosomes in endometrial cancer cells

腫瘤細胞存在營養缺乏、氧氣受限、代謝需求高和氧化應激等病理情況，會干擾胞內蛋白質的折疊能力，從而引起內質網應激。子宮內膜癌細胞同其他腫瘤細胞一樣，存在內質網應激。在子宮內膜癌患者中內質網應激標志物BIP和CHOP含量明顯升高。部分藥物作用于內質網應激通路，可抑制子宮內膜癌細胞的發生發展。藥物雄黃通過內質網應激信號通路使得BIP蛋白質水平增加，以濃度依賴的方式誘導子宮內膜癌JEC細胞發生空泡化和內質網擴張，誘導細胞凋亡和壞死［6］。藥物維替泊芬通常用于PDT，在多種腫瘤中被證實具有抑瘤作用，但具體機制尚不明了。我們前期研究發現維替泊芬通過抑制YAP功能，從而抑制子宮內膜癌細胞的增殖和侵襲。有研究報道維替泊芬引起細胞內發生小囊樣改變，在內質網應激中與蛋白酶體抑制劑具有相同的細胞毒性作用［18］。我們最新的研究發現維替泊芬引起子宮內膜癌細胞出現腫脹，細胞內囊泡樣結構增多。電鏡和Western blot證實維替泊芬誘導的囊泡樣結構正是自噬小體［12］。因此推測維替泊芬可以通過誘導內質網應激，促進細胞自噬和凋亡，從而對子宮內膜癌產生抑制作用。

內質網應激途徑由3種信號蛋白組成：肌醇蛋白-1a（IRE-1a），蛋白激酶 RNA樣內質網激酶（RNA-activated protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）和激活轉錄因子 6（activating transcription factor 6，ATF6）［19-21］。 BIP蛋白作為內質網應激伴侶蛋白，可結合ATF6并響應內質網應激而解離，導致細胞中BIP蛋白質水平增加［19］。在真核內質網中，蛋白質二硫鍵異構酶（PDI）可在蛋白質折疊過程中催化適當的二硫鍵形成［22］，IRE-1a可以將信號從內質網傳遞到細胞質，從而進行細胞間溝通交流。病理情況下，蛋白折疊功能受損，觸發未折疊蛋白反應，造成內質網應激狀態，可在一定程度上維持細胞穩態。如果外界刺激超過細胞平衡限度，細胞可能發生自噬和凋亡［13］。我們的結果與之相符：子宮內膜癌細胞中加入10μmol/L維替泊芬6 h后，IRE-1a蛋白質水平明顯下降，BIP蛋白質水平明顯上升，提示維替泊芬激活IRE-1a的同時促進BIP蛋白的解離。維替泊芬在相對低濃度和長時間作用時（3μmol/L，24 h）通過改變內質網應激信號蛋白BIP、IRE-1a和CHOP，引發細胞的保護性自噬（圖5B），促進P53增加，YAP蛋白質水平降低，誘發細胞凋亡。在相對高濃度和短時間作用時（10μmol/L，6 h），內質網維持穩態的作用被破壞，導致CHOP消失（圖5A），細胞死亡。表明在一定程度刺激下，內質網應激能夠維持細胞中蛋白信號的穩定，而過度的刺激會導致細胞狀態不佳甚至死亡。我們在活細胞成像系統下發現維替泊芬在更低濃度（0.1μmol/L，8 h）時也能促進細胞死亡（圖3）。這種與濃度和時間改變相關的內質網應激蛋白的改變，提示臨床應選擇合理的藥物濃度和作用時間，遵循安全、有效的原則。我們還發現，盡管維替泊芬、MG132和硼替佐米均增加了細胞內BIP、CHOP的蛋白質水平，但是其對IRE-1a和PDI蛋白質水平的影響并不相同，提示其誘導細胞內質網應激的早期機制可能并不相同，有待進一步研究。

內質網應激介導的自噬的特征是自噬小體的產生，當細胞穩態被破壞，與內質網應激相關的自噬小體、溶酶體間接導致細胞的死亡。這個現象與我們此前發表的研究一致［12］，即在維替泊芬作用下自噬相關的LC3蛋白質增加。部分自噬小體外層雙層脂膜來自內質網，其中Rab11蛋白作為關鍵分子參與調節循環內體的形成和運輸。本研究發現在維替泊芬的作用下Rab11蛋白質水平降低，間接證實了維替泊芬誘導自噬小體產生，促進受體和脂質的再循環，加速Rab11蛋白質的耗竭。

本研究證實了維替泊芬在多種子宮內膜癌細胞系中誘導內質網應激，小劑量維替泊芬持續作用一定時間促進細胞發生保護性自噬和凋亡，而大劑量維替泊芬則引發細胞死亡的過程，其引起細胞凋亡或死亡受細胞密度的影響。本研究不足之處在于實驗未涉及維替泊芬在動物體內的機制驗證、藥理學作用、不良反應等，有待進一步研究，以幫助確定維替泊芬在體內的合理作用濃度和時間。本研究為今后進行臨床試驗甚至臨床應用提供了前期基礎。

作者貢獻聲明王博 文獻調研與整理，數據分析，論文撰寫。任曉俊 文獻調研與整理，論文修訂。薛譽 論文修訂。王超 構思與設計，數據分析，獲取資助，監督指導，論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。