胰腺癌組織中TRPC6、B7-H1蛋白表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系

張福昌 張洪彥 焦宇柯

胰腺癌是臨床最為常見的腹部惡性腫瘤之一，惡性程度高，多數(shù)患者就診時(shí)已處于病變晚期，失去了手術(shù)治療機(jī)會，因此患者預(yù)后較差。近年來人們一直在尋找一種和腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的相關(guān)因子，可以預(yù)測腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后。B7家族一直是臨床研究的熱點(diǎn)腫瘤標(biāo)志物，協(xié)同刺激因子B7家族包括了多種受體。B7免疫球蛋白超家族成員-1主要表達(dá)在淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面，在多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞中存在高表達(dá)；瞬時(shí)受體則是鈣離子通道，和神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞增殖與分化密切相關(guān)，通過激活會促進(jìn)胚胎神經(jīng)干細(xì)胞分離增殖，瞬時(shí)受體電位陽離子通道6表達(dá)則同多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展存在密切關(guān)系[1]。本研究分析了胰腺癌組織中瞬時(shí)受體電位陽離子通道6(TRPC6)、B7免疫球蛋白超家族成員-1(B7-H1)蛋白表達(dá)與胰腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取我院收集的手術(shù)后胰腺癌病理標(biāo)本112例及其對應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本，收集時(shí)間2015年3月至2020年1月。納入標(biāo)準(zhǔn)：①胰腺癌患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考胰腺癌綜合診治中國專家共識(2014年版)中的標(biāo)準(zhǔn)；②所有標(biāo)本均來源于手術(shù)切除后標(biāo)本，經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)；③患者年齡19～75歲；④所有患者手術(shù)前無放化療病史；⑤本研究符合相關(guān)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)規(guī)定。排除標(biāo)準(zhǔn)：①胰腺良性腫瘤組織；②病理學(xué)資料缺失；③合并其他部位腫瘤接受放化療、免疫治療的患者。 選取的112例胰腺癌患者，年齡51～75歲，平均(62.2±6.6)歲；男性59例、女性53例；TNM分期：Ⅰ期37例、Ⅱ期54例、Ⅲ期21例；病理學(xué)檢測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的患者有18例、未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者有94例；病灶最大直徑≥3.0 cm 52例、<3.0 cm 60例。

1.2 Western-blot技術(shù)

剪取50 mg胰腺腫瘤組織、癌旁組織，在液氮下碾磨成粉末狀，轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管加入配制好預(yù)冷組織裂解液約1.5 ml，冰上靜置30 min，高速離心機(jī)以12 000 r/min離心25 min，吸取上清液為組織總蛋白，按蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度。按照操作流程采取配膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、雜交、洗滌過程操作，將膜用去離子水漂洗，濾紙貼角吸干，滴加混合液在膜上，3 min后用濾紙貼角吸干，置于保鮮膜內(nèi)固定在片盒中，在暗室內(nèi)迅速蓋上膠片關(guān)閉膠盒，曝光5～20 min取出膠片立即完全浸入顯影液中1～2 min，清水漂洗后放在定影液中至底片完全定影，清水沖凈晾干。使用底片掃描儀掃描膠片，通過凝膠成像儀讀取目的電泳條帶和內(nèi)參的密度掃描值，計(jì)算相對表達(dá)量RI值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 2組患者的TRPC6蛋白、B7-H1蛋白表達(dá)強(qiáng)度比較

胰腺癌癌組織中的TRPC6蛋白、B7-H1蛋白表達(dá)強(qiáng)度均高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見表1、圖1。

表1 2組患者的TRPC6蛋白、B7-H1蛋白相對表達(dá)強(qiáng)度比較

注：1為胰腺癌癌組織，2為癌旁組織。

2.2 胰腺癌組織的TRPC6蛋白、B7-H1蛋白表達(dá)強(qiáng)度與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

在淋巴結(jié)陽性轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者的TRPC6蛋白、B7-H1蛋白表達(dá)強(qiáng)度均高于淋巴結(jié)陰性胰腺癌患者(P<0.05)；在不同TNM分期的胰腺癌組織中，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期胰腺癌組織中的TRPC6蛋白表達(dá)強(qiáng)度呈逐漸增強(qiáng)的趨勢，組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在TNMⅢ期胰腺癌組織中的B7-H1蛋白表達(dá)強(qiáng)度高于Ⅰ期、Ⅱ期患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見表2。

3 討論

胰腺癌是臨床惡性程度較大的腫瘤，預(yù)后較差，且發(fā)病率呈現(xiàn)升高趨勢。雖然隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步惡性腫瘤患者的生存時(shí)間得以延長，生活質(zhì)量得到改善，但是晚期胰腺癌患者的生活質(zhì)量仍較差，主要是晚期腫瘤導(dǎo)致癌性疼痛對患者生理和心理上干擾較大[2]。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展和基因技術(shù)的研究尋找腫瘤治療靶點(diǎn)實(shí)行分子靶向治療已成為腫瘤治療新途徑，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移屬于多步驟、多環(huán)節(jié)的復(fù)雜過程，這一過程中腫瘤細(xì)胞周圍免疫微環(huán)境起到了不同程度促進(jìn)或者抑制效果，T細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)起到了重要作用，尤其是第二信號在免疫應(yīng)答中發(fā)揮傳遞正性信號或者負(fù)性信號協(xié)同效果，決定了T細(xì)胞應(yīng)答是初始、增強(qiáng)、維持還是抑制、弱化或者轉(zhuǎn)變?yōu)闊o反應(yīng)，這些傳遞信號的因子又稱為協(xié)同刺激因子[3-4]。

本研究分析胰腺癌組織中瞬時(shí)受體電位陽離子通道6(TRPC6)、B7免疫球蛋白超家族成員-1(B7-H1)蛋白表達(dá)與胰腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。鈣離子具有維持人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)作用，細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高一般是通過細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放形成，細(xì)胞各種調(diào)控細(xì)胞則精密控制細(xì)胞鈣的內(nèi)流與釋放。瞬時(shí)受體屬于鈣離子通道的一種，廣泛分布在生物、組織器官與細(xì)胞系中，該通道有6個(gè)跨膜多肽，可以裝配成四聚體，在細(xì)胞膜上構(gòu)成離子通道，瞬時(shí)受體電位陽離子通道是最早被報(bào)道的瞬時(shí)受體點(diǎn)位超級組亞族，TRPC6定位在細(xì)胞內(nèi)流動囊泡中，一旦細(xì)胞受到刺激就會流動到細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)揮作用[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)TRPC6過度表達(dá)可以加速細(xì)胞周期中G2期和M期之間過渡，從覆蓋G2期DNA損傷檢驗(yàn)點(diǎn)，會導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生集聚形成突變，發(fā)展為惡性程度更高的細(xì)胞，這些DNA檢查點(diǎn)一旦被破壞就會造成細(xì)胞進(jìn)入分離器引發(fā)基因組不穩(wěn)定，導(dǎo)致基因突變累積，形成惡性腫瘤細(xì)胞[7]。此外TRPC6還同血管生成關(guān)系密切，可以調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，通過TRPC6鈣離子內(nèi)流提升血管通透程度[8]。B7超家族是目前臨床已知協(xié)同刺激信號因子之一，TB7家族已經(jīng)證實(shí)是唯一可以從抗原遞呈細(xì)胞單向傳遞信號到T細(xì)胞協(xié)同刺激因子，對于激活或者抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)至關(guān)重要[9]。B7-H1屬于B7家族新發(fā)現(xiàn)成員之一，在負(fù)性調(diào)節(jié)人體免疫反應(yīng)中具有重要作用，可以優(yōu)先刺激T淋巴細(xì)胞分泌大量的白細(xì)胞介素，抑制T細(xì)胞活化和增殖過程，生理狀態(tài)下正常組織能夠表達(dá)B7-H1下調(diào)T細(xì)胞功能，組織自身反應(yīng)性T細(xì)胞形成，避免了T細(xì)胞對組織過度的反應(yīng)形成自身免疫性疾病[10]。研究顯示，腫瘤細(xì)胞可以表達(dá)和分泌膜分子和可溶性細(xì)胞因子形成腫瘤細(xì)胞生長微環(huán)境，干擾和阻止機(jī)體免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞增殖的監(jiān)控，腫瘤細(xì)胞可以誘導(dǎo)性表達(dá)B7-H1造成腫瘤抗原特效T細(xì)胞凋亡，逃避人體免疫監(jiān)視系統(tǒng)繼續(xù)增殖，因此造成腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移能力的增強(qiáng)，同腫瘤患者預(yù)后具有密不可分的關(guān)系[11]。

表2 胰腺癌組織的TRPC6、B7-H1蛋白相對表達(dá)強(qiáng)度與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

本研究發(fā)現(xiàn)，癌組織中的TRPC6蛋白、B7-H1蛋白表達(dá)強(qiáng)度均高于胰腺癌癌旁組織，TRPC6蛋白、B7-H1蛋白在胰腺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。淋巴結(jié)陽性轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者的TRPC6蛋白、B7-H1蛋白表達(dá)強(qiáng)度均高于淋巴結(jié)陰性胰腺癌患者；Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期胰腺癌組織中的TRPC6蛋白表達(dá)強(qiáng)度呈逐漸增強(qiáng)的趨勢；而TNMⅢ期胰腺癌組織中的B7-H1蛋白表達(dá)強(qiáng)度高于Ⅰ期、Ⅱ期患者，提示了TRPC6蛋白、B7-H1蛋白表達(dá)強(qiáng)度同患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期之間具有一定關(guān)聯(lián)。本研究優(yōu)勢在于利用免疫組化法對TRPC6蛋白、B7-H1蛋白在胰腺癌中的表達(dá)進(jìn)行了測定，這和以往研究結(jié)果相似，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)兩者表達(dá)與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤分期之間關(guān)系密切，這在以往報(bào)道中較為少見。但是本研究樣本量少，缺乏豐富的患者臨床資料及預(yù)后資料，而且對于具體參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制目前尚未明確，還需要擴(kuò)大樣本量，收集患者的詳細(xì)資料以及臨床特征深入分析，為以后胰腺癌基因和免疫治療提供新的方向。

綜上所述，胰腺癌組織中TRPC6蛋白、B7-H1蛋白表達(dá)強(qiáng)度均顯著高于癌旁組織，并且與胰腺癌的發(fā)生及發(fā)展有一定的關(guān)系。