微小RNA-106a靶向PTEN通路對胃癌細胞的增殖與凋亡的調控作用

李 麗 張 靜 郭錦濤

胃癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，是威脅人類生命健康的重大殺手[1]。在所有預測的惡性腫瘤發病率和死亡率中，胃癌位居第三位，約占10%[2-3]。胃癌的快速增殖與凋亡失衡是胃癌患者死亡的主要原因，為改善胃癌預后結局計，需要進行早期診斷與根治[4]。胃癌的確切病因尚未完全闡明，目前認為是幽門螺旋桿菌感染、環境因素和遺傳因素協同作用的結果[5-6]。磷酸酶和張力蛋白同源物(Phosphatase and tensin homologue-deleted chromosome ten gene，PTEN)為編碼403個氨基酸的產物，位于10q23.3具有雙重磷酸酶活性的蛋白，其可拮抗PI3激酶(PI3K)活性，從而促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲活性的增加[7-8]。microRNA是非編碼的內源性小分子RNA，可參與細胞分化、凋亡、生長等過程，其異常表達與腫瘤的發生和發展密切相關[9]。miR-106a是參與細胞的增殖、凋亡和變異等過程的microRNA[10-11]。本文具體探討了miR-106a調控JSTAT3信號通路對胃癌細胞增殖與遷移的影響，希望有助于揭示miR-106a在胃癌中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

胃癌BGC-823細胞株(購自中國科學院細胞庫)，鼠抗人PTEN單克隆抗體(R&D，USA)，山羊抗小鼠β-actin(Santa Cruz公司)，miR-106a引物、β-Actin引物(上海生工生物工程有限公司)，qPCR檢測試劑盒(Takara公司)，miR-106a NC、miR-106a mimics、轉染試劑Lipofectamine 2000(Sigma公司)，胎牛血清、RPMI-1640培養基(Hyclone公司)。

1.2 細胞培養與轉染

BGC-823細胞培養于含10%胎牛血清的RPIM-1640培養基中，于37 ℃、5%CO2培養箱中傳代培養。取對數生長期的U87MG細胞按5×105個/ml的密度接種于培養皿中并分為三組：miR-106a組、對照組與空白組，分別轉染200 ng/ml miR-106a mimic、200 ng/ml miR-NC與等體系的磷酸鹽緩沖液，轉染后6 h后進行換液培養。

1.3 CCK法檢測細胞增殖

制成單細胞懸液(5×105個/ml)，鋪板96孔板，每孔加入200 μl細胞懸液，然后采用CCK-8細胞增殖與活性檢測試劑盒(購自碧云天生物技術有限公司)檢測細胞增殖情況，具體步驟參照試劑盒說明書，最后在490 nm處采用酶標儀中測定吸光值，讀取與計算細胞增殖指數。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡

調整細胞濃度為1×106個/ml，棄上清，重懸后收集細胞，采用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(購自碧云天生物技術有限公司)檢測細胞凋亡，按照試劑盒說明書進行反應后，30 min內進行流式細胞儀檢測，并計算細胞凋亡指數。

1.5 Transwell小室實驗檢測細胞遷移與侵襲

調整濃度為2×105個/ml，在下室加入培養基(含10% FBS)，上室加入細胞懸液，培養24 h；取出上室，采用多聚甲醛室溫固定30 min，然后采用0.4%結晶紫室溫染色15～30 min，中性樹膠封片，鏡下觀察并計算細胞遷移指數。在檢測細胞侵襲中，以2×105個細胞密度接種于24孔板的Transwell小室中，向Transwell小室下加入500 μl的培養液，培養24 h后取出Transwell小室，固定后也進行結晶紫室溫染色15～30 min，中性樹膠封片，鏡下觀察并計算細胞侵襲指數。

1.6 Western blot檢測蛋白表達

全蛋白提取試劑盒(購自碧云天生物技術有限公司)提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量檢測試劑盒(購自碧云天生物技術有限公司)進行蛋白定量，上樣SDS-PAGE膠，轉膜后進行Western blot檢測(β-Actin抗體、PTEN抗體)，圖像分析軟件分析目的蛋白條帶灰度，記錄其相對表達量。

1.7 qRT-PCR檢測基因表達

細胞轉染后24 h與48 h，RNA提取試劑盒(購自碧云天生物技術有限公司)提取細胞總RNA，并反轉錄得到cDNA，并以器為模板，進行qRT-PCR檢測目的基因表達。miR-106a引物：上游：5-'GCCAACGTCAGTAGGCAGA-3'，下游：5-'GCCAACCATGATCTGCTGAAAC-3'。

1.8 統計方法

SPSS 22.0分析所得數據，實驗數據采用均數±標準差進行表示，采用t檢驗和采用單因素方差分析進行組間的數據對比，以ɑ=0.05作為檢驗水準。

2 結果

2.1 miR-106a表達對比

細胞轉染24 h與48 h后，miR-106a組的miR-106a相對表達量顯著高于空白組和對照組(P<0.05)，而后兩組對比差異無統計學意義(P>0.05)；與24 h時相比，48 h時miR-106a組細胞miR-106a相對表達量顯著增高(P<0.05)，另外兩組兩個時間點相比差異不具有統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 三組miR-106a相對表達量對比

2.2 細胞增殖指數對比

細胞轉染24 h與48 h后，miR-106a組的細胞增殖指數較空白組和對照組顯著降低(P<0.05)，而后兩組相比差異不具有統計學意義(P>0.05)。與24 h時相比，48 h時miR-106a組細胞增殖指數顯著增加(P<0.05)，另外兩組兩個時間點相比差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 三組細胞增殖指數對比

2.3 細胞凋亡情況對比

細胞轉染后24 h與48 h，與空白組和對照組相比，miR-106a組細胞凋亡指數顯著增加(P<0.05)。與24 h時相比，48 h時三組細胞凋亡指數顯著增加(P<0.05)，見表3。

表3 三組細胞凋亡指數對比

2.4 細胞遷移與侵襲指數對比

細胞轉染后24 h與48 h，與空白組和對照組相比，miR-106a組細胞遷移與侵襲指數顯著降低(P<0.05)。與24 h時相比，48 h時三組細胞遷移與侵襲指數顯著增加(P<0.05)，見表4。

表4 三組細胞遷移與侵襲指數對比

2.5 PTEN蛋白表達對比

轉染后24 h與48 h，miR-106a組PTEN蛋白相對表達水平均顯著低于空白組和對照組(P<0.05)。與24 h時相比，48 h時三組細胞PTEN蛋白相對表達水平顯著降低(P<0.05)，見表5。

表5 三組細胞PTEN蛋白相對表達水平對比

3 討論

胃癌是威脅人類生命健康的重大殺手。早期胃癌的5年生存率在90%以上，而晚期胃癌的生存率低于10%[12]。腫瘤增殖和凋亡是極其復雜的發展過程，對其進行早期干預能顯著性地提高患者生存率[13]。miRNA是一類高度保守的非編碼RNA，參與細胞生長、增殖、發育、分化、凋亡、遷移等生命活動[14]。miR-106a是miR家族中重要的一員，是與人類腫瘤密切相關的miRNA之一，調控細胞的增殖、分化、形成抗藥性以及編碼炎性蛋白、造血和紅細胞生成、腫瘤抑制基因等過程[15-17]。本研究顯示細胞轉染后24 h與48 h，與空白組和對照組相比，miR-106a組的細胞增殖指數顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡指數顯著增加(P<0.05)，表明miR-106a的過表達能抑制胃癌細胞增殖，促進細胞凋亡。

相關研究表明：miRNA可在轉錄后水平通過抑制靶基因mRNA翻譯或誘導靶基因mRNA降解來調控靶基因的表達，從而參與早期胚胎發育、腫瘤發生發展、細胞增殖和凋亡等過程[18]。本研究顯示細胞轉染后24 h與48 h，與空白組和對照組相比，miR-106a組的細胞遷移與侵襲指數顯著降低(P<0.05)，表明miR-106a的過表達能抑制胃癌細胞轉移與侵襲。

胃癌的發生包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活，一旦它們表達失調，則有可能快速地促進腫瘤的形成。miRNA可通過靶向于不同的促癌或者抑癌基因而在胃癌形成中產生類似腫瘤抑制因子或者促癌因子的作用[19-20]。PTEN參與調節腫瘤細胞的浸潤和轉移，從而發揮抑癌基因作用。有研究表明PTEN或其蛋白的丟失與惡性腫瘤的進展顯著相關，胃癌組織PTEN蛋白表達陽性率高于相鄰正常組織，從而發揮促癌基因作用[21-22]。miRNA是通過抑制靶基因PTEN的表達而發揮作用，其可與PTEN mRNA的3'-非翻譯區結合抑制其轉錄翻譯，從而參與調控單核細胞凋亡延遲[23-24]。本研究顯示細胞轉染后24 h與48 h，miR-106a組的PTEN蛋白相對表達水平較空白組和對照組顯著降低(P<0.05)，而后兩者相比差異不具有統計學意義。表明miR-106a的過表達能靶向抑制PTEN信號通路的激活。

本研究不足之處在于--僅初步闡述了miR-106a與PTEN在胃癌細胞中關系，其對于胃癌的調控作用仍需要進一步的實驗研究來完善。綜上所述，miR-106a的過表達可靶向抑制PTEN信號通路的激活，從而抑制胃癌細胞增殖、遷移與侵襲，促進細胞凋亡。