右美托咪定對順鉑誘導的非小細胞肺癌細胞凋亡及氧化應激的影響

任 斐 王 敏 徐小矛

肺癌是世界上發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，從臨床角度出發，結合肺癌的生物學特性，可將其分為小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)[1]。SCLC約占所有肺癌的15%，而NSCLC占85%，且NSCLC對放療和化療的敏感性明顯低于SCLC。NSCLC主要包括肺腺癌、肺鱗癌和肺大細胞癌[2]。由于肺癌早期臨床表現不明顯，發現較晚，腫瘤細胞已發生淋巴轉移和遠處轉移，死亡率極高，預后也較差，5年生存率僅為15%～20%，嚴重威脅人類的生命健康[1]。順鉑是目前治療肺癌最常用的一線化療藥物，但是因其嚴重的毒副作用和耐藥性的產生限制了它的應用[3]。因此增強癌細胞對順鉑的敏感性，降低順鉑耐藥性，對NSCLC治療起至關重要的作用。右美托咪定(Dex)是1種有效的 2腎上腺素能激動劑，具有鎮靜、鎮痛、阻滯交感神經等作用。近期的研究表明，Dex可促進SKOV3卵巢癌細胞的凋亡，減弱細胞的遷移和侵襲[4]。但是對其在肺癌細胞順鉑耐藥性中的作用卻甚少報道，本研究旨在探討Dex對肺癌細胞順鉑耐藥性的影響，并試圖分析其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養及分組

人非小細胞肺癌細胞系NCI-H23購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心，將細胞培養在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，與37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養箱中培養。取對數生長期的細胞分為3組：對照組、順鉑組和Dex組。各組干預方式。順鉑組：采用3 g/ml的順鉑孵育24 h；Dex組：先用1 nM的Dex孵育15 min，然后再用3 g/ml的順鉑孵育24 h；對照組用加入同劑量的培養基孵育24 h。順鉑和Dex均購自美國Sigma公司。

1.2 Western Blot

采用RIPA試劑從各組細胞中提取總蛋白，BCA試劑盒對總蛋白進行定量。取20 g的總蛋白加入上樣緩沖液中，用10%的SDS-PAGE凝膠分離總蛋白。經轉膜后用5%的BSA封閉45 min，孵育1抗，4 ℃過夜。孵育辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5000)，室溫搖床孵育45 min。化學發光試劑ECL暗室發光。條帶及數據的分析采用美國Bio-rad公司的凝膠成像系統以及Quantity One 4.6.2軟件。一抗及稀釋倍數為：Cytochrome C抗體(1∶1000)、Cleaved Caspase-3抗體(1∶800)、Bax抗體(1∶800)、Bcl-2抗體(1∶1000)、mTOR抗體(1∶800)、ERK1/2抗體(1∶1000)、Phospho-Erk1(Thr202/Tyr204)/Erk2(Thr185/Tyr187)抗體(1∶600)、E-鈣粘蛋白抗體(1∶600)以及內參-actin(1∶5000)均購自上海碧云天公司，Cleaved Caspase-9抗體(1∶1000)和p(S2448)-mTOR抗體(1∶600)購自美國Abcam公司。

1.3 活性氧(ROS)含量的檢測

采用活性氧檢測試劑盒檢測各組細胞中ROS的含量，試劑盒購自上海碧云天公司。將收集的細胞懸浮于10 mol/l的DCFH-DA稀釋液中，調整細胞濃度為1×107個/ml。于37 ℃培養箱中培養20 min后，無血清培養液洗3次，應用熒光酶標儀在激發波長488 nm，發射波長525 nm處檢測熒光強度。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 Dex對順鉑誘導的肺癌細胞凋亡相關蛋白表達的影響

與對照組相比，順鉑組和Dex組Caspase 3、Caspase 9和Bax的表達顯著增加(P<0.05)，Dex組高于順鉑組(P<0.05)。與對照組相比，順鉑組和Dex組Bcl-2表達顯著降低(P<0.05)，順鉑組和Dex組間比較無顯著差異，見表1。

表1 各組Caspase 3、Caspase 9、Bax和Bcl-2表達水平對比

2.2 Dex對順鉑誘導的肺癌細胞ROS產生和細胞色素C釋放、E-鈣粘蛋白表達及mTOR/ERK1/2信號途徑激活的影響

與對照組相比，順鉑組和Dex組ROS的含量及細胞色素C的釋放顯著增加(P<0.05)，Dex組高于順鉑組(P<0.05)。Dex組p-mTOR的表達顯著低于對照組和順鉑組(P<0.05)，對照組和順鉑組間比較無顯著差異。與對照組相比，順鉑組和Dex組p-ERK1/2的表達顯著降低(P<0.05)，Dex組低于順鉑組(P<0.05)。各組間mTOR和ERK1/2的表達無顯著差異。Dex組E-鈣粘蛋白的表達顯著低于對照組和順鉑組(P<0.05)，對照組和順鉑組間比較無顯著差異(P>0.05)，見表2。

表2 各組ROS、細胞色素C、E-鈣粘蛋白、mTOR/ERK1/2信號途徑激活含量的對比

3 討論

雖然已經報道了Dex具有促進SKOV3卵巢癌細胞凋亡的作用，但矛盾的是，在關于Dex和順鉑的研究中顯示，Dex可以降低順鉑處理后腎組織中Bax的表達及p53和caspase-3的活性[5]，表明Dex具有抗凋亡的作用，因此，Dex在癌細胞中的作用還有待進一步研究。本研究中顯示，Dex可進一步增加順鉑誘導的促凋亡蛋白Caspase 3、Caspase 9和Bax表達的增加，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，表明Dex可激活肺癌細胞的內在凋亡途徑。Dex可上調肺癌細胞線粒體中Bax/Bcl-2的比值，導致線粒體跨膜電位消失，線粒體滲透轉運孔開放，導致細胞色素C從線粒體釋放至細胞質，caspase 9自剪接而激活，再依次激活caspase 3等，直接降解胞內的結構蛋白和功能蛋白，引起細胞凋亡[6]。本研究中接下來對細胞色素C的研究也證明了這一點，Dex可促進順鉑誘導的肺癌細胞中細胞色素C的釋放，進而導致caspase瀑布式激活，誘導凋亡。由于Dex是 2腎上腺素能激動劑，因此Dex的促凋亡作用可能與 2腎上腺素能的激活有密切關系，但具體的作用效果及機制還有待進一步探討。

細胞色素C的釋放常常伴隨ROS的產生，在生物學上，ROS是體內一類氧的單電子還原產物，是電子在未能傳遞到末端氧化酶之前漏出呼吸鏈并消耗大約2%的氧生成的，主要包括超氧陰離子自由基(O2-)、H2O2、羥基自由基(OH-)和次鹵酸(如次氯酸)[7]。在本研究中，Dex可進一步促進順鉑誘導的肺癌中ROS的水平，表示Dex的促凋亡作用可能與氧化應激有關。ROS可介導多種細胞信號轉導途徑，包括細胞增殖途徑及血管生成途徑[8]。mTOR和ERK1/2參與癌細胞的增殖/存活途徑[9]，本研究顯示，順鉑可顯著抑制ERK1/2的活性，但是對mTOR的活性無顯著影響。而Dex可進一步抑制順鉑導致的mTOR和ERK1/2蛋白失活，表明其可進一步增強順鉑對肺癌細胞增殖的抑制作用，增強肺癌細胞對順鉑的敏感性，對肺癌的治療具有積極作用。

此外，細胞表面粘附分子E-鈣粘蛋白在細胞內部與細胞骨架成分連接，在細胞表面提供細胞膜之間的連接，因此對細胞與細胞的附著作用至關重要，在腫瘤細胞的轉移過程中起重要的促進作用[10]。本研究中，順鉑對E-鈣粘蛋白的表達無顯著影響，但是Dex可顯著抑制肺癌細胞中E-鈣粘蛋白的表達，提示Dex可能通過抑制E-鈣粘蛋白的表達進而在阻止肺癌細胞轉移過程中起重要作用，但是具體的結果還有待進一步研究。

本研究已經闡明了Dex對順鉑誘導的肺癌細胞凋亡具有促進作用。但是也存在一些局限性，這些局限性值得進一步研究：①關于mTOR和ERK1/2信號通路的研究，可用特異性抑制劑去阻斷信號通路，這樣可以針對性地探索這些通路在細胞活動中的作用。②關于Dex對肺癌細胞中ROS產生的研究，還需要進一步的研究來驗證Dex對氧化應激的影響，包括Dex對抗氧化酶(SOD，GPX和CAT)的影響。高水平的ROS通常對細胞有不利作用，但是癌細胞的氧化還原狀態與正常細胞的氧化還原狀態有所不同。由于代謝和信號轉導異常，導致癌細胞中ROS水平增加，進而阻止腫瘤的發展。但是ROS還可通過誘導DNA突變和促癌基因信號轉導途徑促進腫瘤形成。這些矛盾的影響預示著調節ROS水平在潛在的抗癌策略中具有重要意義[11]。因此Dex對氧化應激的調節作用可能作為治療癌癥的新策略[11-12]。

總之，本研究通過體外實驗表明Dex可進一步促進順鉑誘導的肺癌細胞凋亡，機制可能與其抑制mTOR和ERK1/2增殖信號通路的活性及抑制E-鈣粘蛋白的表達有關。