miR-374a對肺腺癌細胞增殖與侵襲遷移的影響

孫繼偉 袁五營 賈敬周

肺癌是常見的呼吸系統惡性腫瘤，死亡率逐年攀升，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)作為肺癌中最為常見的發病類型，約占全部肺癌發病率的80%[1-2]。肺癌起病一般多隱匿，大部分患者在明確診斷時已處于癌癥晚期，多伴有不同程度的腫瘤浸潤和遠處轉移表現，因此預后療效一般不甚理想[3]。MicroRNAs(miRNAs)是一類只有20～24個核苷酸的單鏈非編碼RNAs，主要在轉錄后水平調控基因的表達，在腫瘤細胞的增殖、侵襲、遠處轉移、腫瘤血管生成以及免疫逃避等生物學行為中發揮著重要作用[4]。研究表明，NSCLC中存在多種miRNA的表達異常，如miR-146a呈明顯高表達，具有一定的促癌活性[5]。miR-374a在不同物種間的序列高度保守性，在生物體的生理、病理過程中可能發揮重要的作用。但NSCLC中，miR-374a相關研究仍鮮有報道。為明確miR-374a在非小細胞肺癌中的表達和功能，本研究構建體外研究模型，探討miR-374a在非小細胞肺癌細胞A549及H1795中的表達情況以及其對非小細胞肺癌細胞增殖、遷移、侵襲等生物學行為能力的影響，以期為臨床評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 實驗用人正常肺上皮細胞株CCD-8L以及人非小細胞肺癌細胞株A549、人非小細胞肺癌細胞株H1975均購于ATCC(american type culture collection)。

1.1.2 主要試劑 Eagle's MEM培養基、DMEM培養基、FBS胎牛血清、胰蛋白酶購于美國Gibco公司；裂解液Trizol購于Invitrogen公司；細胞RNA提取試劑盒、實時熒光定量逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq實時熒光定量 PCR試劑盒均購于日本TaKaRa公司；Matrigel膠購于美國BD公司；二甲基亞砜(DMSO)購于美國MP公司；GenMuteTm reagent購于美國SignaGen公司4%多聚甲醛、甲醇、氯仿等購上海翊圣生物科技有限公司；miR-374a control、miR-374a mimic、miR-374a inhibitor均購于上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將CCD-8L細胞置于含10%FBS胎牛血清Eagle's MEM培養基中，于5% CO2、37 ℃條件下培養。將A549細胞及H1975細胞置于含10%FBS胎牛血清DMEM培養基中，于5% CO2、37 ℃條件下培養。取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 細胞瞬時轉染 根據GenMuteTm reagent(signagen)試劑操作指南進行轉染(六孔板為例)，用雙無DMEM培養基100 μl分別稀釋miR-374a control、miR-374a mimic、miR-374a inhibitor至10 nmol/l，另各取80 μl ddH2O，20 μl 5×transfection buffer，4 μl genmute到5μl上述雙無DMEM培養基中，輕輕混勻后室溫下孵育20 min待用。

取對數生長期A549、H1975細胞以1.5×105個/ml分別接種于6孔板，以次日貼壁細胞量達50%～60%為宜，次日分別將稀釋好的miR-374a control、miR-374a mimic、miR-374a inhibitor加入不同孔槽中，然后每孔加入1ml完全培養基，輕輕吹打混勻，常規培養48 h，采用RT-PCR實驗檢測轉染前后miR-4500表達水平改變情況。

1.2.3 RT-PCR 各組A549、H1975細胞總RNA提取采用Trizol法。除去6孔板中細胞培養液，每孔加PBS 1 ml洗滌細胞2次，每孔中加入Trizol 1 ml，反復吹打，室溫靜置5～10 min。隨后收集6孔板中混合液吸取至1.5 ml EP管中，冰上靜置2 min。按每1 ml Trizol加入0.2 ml氯仿，用振蕩器振蕩EP管15s左右，使氯仿和Trizol充分混合，冰上靜置3～5 min，4 ℃，12 000 g離心15 min。取上清液，加入異丙醇0.5 ml，混勻后冰上靜置10 min，4 ℃，12 000 g離心5 min。棄上清，取離心沉淀加入預冷的75%乙醇1 ml，吹打混勻后，4 ℃，7 500 g離心5 min。去上清，吸取殘余酒精，超凈臺中風干，加入20～40 μl DEPC水溶解RNA沉淀。用紫外分光光度儀測定總RNA濃度與純度，A260/280在1.8～2.0。按照mRNA反轉錄試劑盒操作說明進行反轉錄，cDNA稀釋至100 μl置冰浴待用或-20 ℃保存。各樣本逆轉錄產物cDNA需要量為2.0 μl，利用SYBR Green I法[試劑盒 SYBR Premix Ex Taq Kit(Takara)]在熒光定量PCR儀上行qPCR檢測。反應程序：95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個循環，所有試驗重復3次，采用相對定量分析按照2-(△△Ct(實驗組)-△△CT(對照組))求出各組細胞中miR-374a表達水平。miR-374a引物及內參引物均由上海捷瑞生物工程有限公司設計合成，見表1。

表1 miR-374a引物及內參引物序列

1.2.4 CCK8細胞增殖實驗 收集生長對數期A549、H1975細胞制成細胞懸液，離心后重懸細胞，調整懸液細胞濃度至5000個/ml，96孔板每孔加入細胞懸液100 μl，每組3個復孔，置于37 ℃ 5%CO2培養箱常規培養24 h。分別轉染miR-374a control、miR-374a mimic、miR-374a inhibitor后，置于37 ℃ 5%CO2培養箱常規培養，分別于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h時于每孔加入10 μl CCK8試劑，繼續置于培養箱中放置2 h，用酶標儀測定其在450 nm處的吸光度(OD)值。以相對應OD值表示細胞增殖能力大小，繪制細胞生長曲線，觀察各組細胞增殖能力變化情況。

1.2.5 細胞平板克隆實驗 取對數生長期細胞A549、H1975分別用胰酶消化后制成細胞懸液，離心后重懸細胞，調整懸液細胞濃度，以每孔1×103接種于6孔板，按瞬時轉染分組，分別轉染miR-374a control、miR-374a mimic、miR-374a inhibitor，并添加PEDF蛋白，置于37 ℃ 5%CO2培養箱常規培養。每3天更換1次培養基，約10天后，肉眼即可看到細胞克隆時，吸去培養基，用PBS溶液輕輕漂洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS溶液輕輕漂洗2次，每孔加入1 ml 0.5%結晶紫染液染色20 min。洗去多余染液，在顯微鏡下觀察計數大于50個細胞的克隆數，每組實驗獨立進行3次,每次3個復孔。

1.2.6 Transwell細胞遷移實驗 取對數生長期的轉染miR-374a control、miR-374a mimic、miR-374a inhibitor細胞A549、H1975常規消化，終止消化后離心棄去上清液，加無血清培養基200 μl重懸細胞，輕輕吹打混勻后細胞計數，加適量無血清培養基調整細胞密度至5×105個/ml，向每個Transwell小室中加入200μl細胞懸液，并在24孔板每孔對應加入600 μl的完全培養基，將小室放入孔中，培養箱培養24 h。取出Transwell小室，吸凈孔中培養液，PBS清洗兩遍，4%多聚甲醛固定30 min后，再次用PBS洗兩遍，用0.1%的結晶紫染料染色3 min，再用棉簽輕輕地擦掉里層未遷移細胞，用PBS洗3遍，將小室放置風干。400倍顯微鏡下隨機四個視野觀察細胞，計數穿過微孔移到濾膜下層的細胞總數，共計數中央及四周各5個視野并取其平均值。

1.2.7 Transwell細胞侵襲實驗 用4 ℃預冷的無血清培養基于冰上稀釋Matrigel至終濃度1 mg/ml，Transwell上室底部中央垂直加入50 μl稀釋后的Matrigel，37 ℃靜置2 h使其凝固成膠狀，進行Matrigel膠預處理。

取對數生長期轉染miR-374a control、miR-374a mimic、miR-374a inhibitor的細胞A549、H1975常規消化，終止消化后離心棄去上清液，加無血清培養基200 μl重懸細胞，輕輕吹打混勻后細胞計數，加適量無血清培養基調整細胞密度至1×106個/ml，向每個鋪膠的Transwell小室中加入200 μl細胞懸液，并在24孔板每孔對應加入600 μl的完全培養基，然后將小室放入孔中，培養箱培養24 h。取出Transwell小室，吸凈孔中培養液，棉簽拭去小室內部的Matrigel膠，PBS清洗兩遍，4%多聚甲醛固定30 min后，再次用PBS洗兩遍，用0.1%的結晶紫染料染色3 min，再用棉簽輕輕地擦掉里層未遷移細胞，用PBS洗3遍，將小室放置風干。400倍顯微鏡下隨機四個視野觀察細胞，計數穿過微孔移到濾膜下層的細胞總數，共計數中央及四周各5個視野并取其平均值。

1.3 統計學處理

應用SPSS 19.0統計軟件進行分析。計量資料采用均數±標準差表示，若數據符合正態分布、方差齊，則采用兩獨立樣本t檢驗；若方差不齊，則采用近似t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-374a在非小細胞肺癌細胞中的表達情況

RT-PCR實驗結果顯示，與人正常肺上皮細胞比較，在非小細胞肺癌細胞 A549、H1975中，miR-374a呈明顯高表達(P<0.05)，組間差異顯著，具有統計學意義，見圖1。

圖1 miR-374a在非小細胞肺癌細胞中的表達情況

2.2 miR-374a mimic和miR-374a inhibitor轉染效率情況

RT-PCR實驗結果顯示，在兩組非小細胞肺癌細胞中，與control組比較，miR-374a mimic組細胞miR-374a表達水平均明顯較高(P<0.05)，miR-374a inhibitor組細胞miR-374a表達水平則明顯低于control組(P<0.05)，組間差異具有顯著統計學意義，見圖2。

圖2 miR-374a mimic和miR-374a inhibitor轉染效率情況

2.3 miR-374a對非小細胞肺癌細胞增殖能力的影響

CCK8細胞增殖實驗結果顯示，與control組細胞比較，在轉染120h時，miR-374 mimic組非小細胞肺癌細胞的增殖率明顯較高(P<0.05)，miR-374a inhibitor組非小細胞肺癌細胞細胞的增殖率則明顯較低(P<0.05),組間差異顯著，具有統計學意義。見圖3。

注：A為A549細胞；B為H1795細胞。

2.4 miR-374a對非小細胞肺癌細胞平板克隆形成能力的影響

細胞單克隆實驗結果顯示，兩組非小細胞肺癌細胞中，與control組比較，miR-374 mimic組細胞單克隆能力明顯較強(P<0.05)，miR-374a inhibitor組細胞單克隆能力則明顯受到抑制(P<0.05)，組間差異明顯，具有統計學意義。見圖4。

2.5 miR-374a對非小細胞肺癌細胞遷移能力的影響

Transwell細胞遷移實驗結果顯示，與control組非小細胞肺癌細胞比較，miR-374a mimic組非小細胞肺癌細胞細胞的遷移能力明顯較高(P<0.05)，miR-4500 inhibitor組膠質瘤細胞的遷移能力則明顯較低(P<0.05)，組間差異具有統計學意義。見圖5。

圖4 miR-374a對非小細胞肺癌細胞平板克隆形成能力影響

圖5 miR-374a對非小細胞肺癌細胞遷移能力的影響

2.6 miR-374a對非小細胞肺癌細胞侵襲能力的影響

Transwell細胞侵襲實驗結果顯示，與control組比較，miR-374a mimic組細胞侵襲能力明顯較強(P<0.05)；且與control組比較，加入miR-4500 inhibitor處理后，miR-4500 inhibitor組細胞侵襲能力明顯降低(P<0.05)，組間差異具有統計學意義。見圖6。

圖6 miR-374a對非小細胞肺癌細胞侵襲能力的影響

3 討論

miRNAs是1類單鏈小分子非編碼RNA，具有物種保守性，在細胞周期、分化、生長、凋亡以及各種應激反應中扮演著重要角色[6]。近年來越來越多研究表明，miRNAs在眾多腫瘤的發生發展過程中具有不同程度的異常表達，且同1種miRNAs在不同腫瘤中的表達及作用也不盡相同[7]。現已發現許多實體瘤中都有各自特異的miRNA表達譜，盡管目前并不完全清楚這些異常表達的miRNA是否是影響腫瘤發生發展及預后的根本原因，但是，這些miRNA在腫瘤中的作用卻是顯而易見的。

研究證實，miRNA與非小細胞肺癌(NSCLC)的發生發展密切相關，miRNA的異常表達與NSCLC患者吸煙狀態、腫瘤大小、淋巴結轉移和TNM分期顯著相關，不僅可作為潛在的NSCLC預后預測分子標志物，部分miRNA的聯合診斷還可用作NSCLC早期診斷的候選標志物[8-9]。應朝輝等探究miRNA-106b-5p表達對接受靶向治療NSCLC患者預后的影響發現，miRNA-106b-5p高表達與靶向治療NSCLC患者不良預后相關，miRNA-106b-5p高表達是影響靶向治療NSCLC患者預后的獨立危險因素，提示miRNA在NSCLC的預后評估中具有重要參考價值[10]。miRNA-374a是1個研究相對較少的miRNA，位于染色體Xq13.2，在腫瘤的調節中既可發揮促癌作用也可起到一定的抑癌作用[11]。有研究表明，與癌旁正常組織相比，miR-374a在早期NSCLC組織中呈現高表達，且與腫瘤細胞增殖具有一定關系[12]。比較健康人血清與NSCLC患者血清中miR-374a的表達水平，NSCLC患者血清中miR-374a含量明顯較高，提示血清miR-374a有望成為1種新的生物標志物用于NSCLC的輔助診斷[13]。Wang等[14]體內外實驗結果顯示，miR-374a可通過靶向Wnt5a相關信號通路作用，調節NSCLC的EMT進程，抑制腫瘤細胞的增殖，提示miR-374a對于NSCLC的疾病進展具有一定的抑制作用。有學者[15]研究同樣證實，過表達miR-374a可抑制肺腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，miR-374a可通過直接靶向負調控TGFA基因表達，發揮抑癌基因作用。目前已有多項miR-374a在肺癌中的作用研究結果相悖，提示miR-374a在肺癌中作用復雜，其調節的具體信號通路需要深入研究。

本研究擬在體外實驗中，通過比較人正常肺上皮細胞及NSCLC細胞中miR-374a的表達量，明確miR-374a在NSCLC細胞中的表達，并通過瞬時轉染技術上調和下調NSCLC細胞中miR-374a的表達水平，進一步探究miR-374a對NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。實驗結果顯示，相較于人正常肺上皮細胞CCD-8L，NSCLC細胞A549、H1795中miR-374a呈穩定高表達，與既往研究一致。接著，我們對NSCLC細胞A549、H1795進行了miR-374a mimic、miR-374a inhibitor瞬時轉染，調節NSCLS中miR-374a的表達情況，RT-PCR結果顯示轉染效率高，miR-374a mimic、miR-374a inhibitor可分別瞬時過表達、低表達非小細胞肺癌細胞A549、H1975中miR-374a表達情況(P<0.05)，具有統計學意義。在此基礎上，我們分別采用CCK8實驗、平板克隆實驗和Transwell細胞遷移、侵襲實驗對改變miR-374a表達水平后NSCLC細胞的生物學行為能力進行了探究。實驗結果顯示，采用miR-374a mimic過表達miR-374a可促進NSCLC細胞A549、H1975的增殖、遷移和侵襲(P<0.05)，采用miR-374a inhibitor則可靶向抑制miR-374a的表達，并抑制NSCLC細胞A549、H1975的增殖、遷移和侵襲(P<0.05)，提示miR-374a在NSCLC的發生發展過程中發揮著促癌作用。但有既往研究指出[16]，miR-374a不僅在不同的NSCLC細胞中發揮的功能不同，其在NSCLC發生發展不同階段扮演的角色也不盡相同，在后續的實驗中，我們將采用慢病毒穩轉技術，在不同NSCLC細胞及同一細胞的不同生長周期中進一步探究miR-374a的作用及機制。

綜上所述，miR-374a在非小細胞肺癌細胞A549、H1975中呈穩定高表達，且具有一定的促進腫瘤細胞增殖、克隆、遷移和侵襲的能力。具體的作用機制及相關靶基因有待進一步探究。