miR-192在膠質瘤U251細胞中的表達及對其增殖、遷移及凋亡能力的影響

劉明亮 鄭衛華 丁新生

腦膠質瘤是最常見的原發性顱內腫瘤，起源于神經膠質細胞，其發病機制尚未明確[1]。膠質瘤的治療以手術治療為主，結合放療、化療等綜合治療，但病死率仍較高，僅次于肺癌和胰腺癌[2]。膠質瘤早期癥狀不明顯，確診時大多已是中晚期，治療效果較差，嚴重影響患者的生存時間[3]。微小RNA(MicroRNA，miRNA)是1類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，通過多種信號途徑抑制或促進腫瘤的發生發展[4-5]。研究發現，miR-192可細胞周期阻滯于于G1/G2期，在結腸癌、子宮內膜癌等癌組織中表達下調，被認為是1種腫瘤抑制性miRNA[6]。miR-192在膠質瘤中的表達及對其發生發展的影響尚未見報道。因此本研究通過分析miR-192對膠質瘤U251細胞生物學行為的影響，旨在為膠質瘤的發生機制和診療提供新的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人膠質瘤細胞株U251、LN18、U373 和正常人腦膠質細胞株HEB均來自中科院上海細胞庫。RPMI-1640培養基(Gibco公司)、胎牛血清FBS及胰蛋白酶(HyClone公司)；逆轉錄試劑盒(DBI公司)；轉染試劑盒(Invitrogen公司)；miR-192 mimics；RT-PCR試劑盒(DBI公司)；TRIzol(Takara公司)；CCK-8試劑盒(Dojindo公司)；Transwell小室(Corning公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與轉染 細胞培養選用RPMI-1640培養基，置于5%的CO2體積分數、37 ℃條件的培養箱中培養。每2～3天更換培養基，將生長狀態穩定的U251細胞在6孔細胞培養板接種并培養24 h，隨后按照LipofectamineTM RNAiMAX說明書進行轉染，以miR-192 mimics為實驗組，以miRNA negative control(miR-NC)為陰性對照組。miR-192 mimics序列：5'-CUGACCUAUGAAUUGACAGCC-3'，miR-NC序列：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'。

1.2.2 RT-PCR法檢測不同細胞株中miR-192表達 采用RNA抽提試劑盒提取各細胞株中總RNA，用熒光定量檢測試劑盒進行定量檢測，以U6為內參，正向引物為5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，反向引物為：5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。miR-192正向引物為5'-GGGGCTGACCTATGAATTGA-3'，反向引物為：5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。逆轉錄合成cDNA保存于-80 ℃冰箱中備用。擴增體系：cDNA 2 μl，Primer 1 μl，RNase H2O 7 μl，SYBR Primix Ex TaqTM 10 μl。miR-192的相對表達量采用2-ΔΔCt表示。

1.2.3 CCK-8檢測U251細胞的增殖能力 具體實驗過程依據CCK-8試劑盒說明書進行。將轉染24 h的U251細胞以每孔(1～2)×103個細胞接種于96孔培養板中，每孔體積100 μl，另僅加培養基作為空白對照，兩組均分別培養5天。將10 μl CCK-8加入每孔中，在37 ℃條件下培養2 h。酶標儀上450 nm測定每孔吸光度(optical density，OD)值。各組取3孔平均值作為表示細胞增殖能力的大小，并繪制增殖曲線。

1.2.4 平板克隆實驗 將轉染后的兩組細胞以每孔200個接種于6孔細胞培養板中，每孔加入2 ml培養液后，將培養板置于5%體積分數CO2、37 ℃的培養箱中，培養2周。當出現肉眼可見的集落形成后，終止培養。隨后移除培養液，將1 ml PBS加入，洗滌細胞，再用4%的多聚甲醛固定15 min，吉姆薩染色法染色20 min，置于空氣中干燥。計數可見的克隆數。克隆形成率=(克隆形成數/接種總細胞數)×100%。

1.2.5 Transwell實驗檢測U251細胞的遷移能力 將600 μl RPMI 1640和10% FBS的培養基，加入24孔板，放入Transwell小室。使用0.25%胰蛋白酶消化轉染24 h后的miR-192 mimics組和miR-NC組細胞，吹打成單細胞懸液。在Transwell 小室上層，以每孔200 μl 1×104個細胞接種，并對每組細胞設置3個復孔，48 h后，用PBS洗滌細胞3次。使用4%多聚甲醛固定30 min，再次應用PBS洗滌細胞，蘇木精染色30 min后，流水清洗，拍照，計數。

1.2.6 流式細胞術檢測U251細胞的凋亡率 轉染48 h后收集消化后細胞，制成單細胞懸液，經5 min離心(1200 r/min)后，棄上清。PBS洗滌2次，500 μl 1×Binding Buffer重懸細胞，加入5 μl FITC標記的Annexin V和10 μl 的PI。混合均勻后，在室溫下孵育5 min，放入流式細胞儀檢測。

1.2.7 hsa-miR-192靶基因的預測 應用miRWalk數據庫(http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/)預測miR-192潛在靶基因，使用miRanda、Targetscan、miRWalk、Microt4和RNAhybrid 5種工具預測基因，取其交集。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 miR-192在膠質瘤細胞和正常人腦膠質細胞中的表達

RT-PCR法檢測人膠質瘤細胞株U251、LN18、U373和正常人腦膠質細胞株HEB中miR-192的表達，發現miR-192在膠質瘤細胞株U251、LN18、U373中的表達均明顯低于HEB(P<0.05)。在膠質瘤細胞株U251、LN18、U373中，U251細胞中miR-192表達最低，選擇U251膠質瘤細胞進一步分析。見圖1。

圖1 膠質瘤細胞和正常人腦膠質細胞中miR-192的表達

2.2 miR-192對U251細胞增殖的影響

CCK-8法檢測轉染miR-192 mimics和miR-NC細胞后1～5 d的OD值，繪制生長曲線，橫坐標為時間，縱坐標為OD值。結果顯示：與miR-NC組細胞相比，轉染miR-192 mimics細胞的OD值在4、5 天時均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。平板克隆實驗顯示miR-192 mimics轉染細胞的克隆形成率為(28.23±0.81)%，明顯低于miR-NC細胞[(41.59±1.21)%]，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖2 轉染兩組細胞后U251細胞生長曲線

注：A為miR-192 mimics組細胞；B為miR-NC組細胞；C為克隆形成率。

2.3 miR-192 mimics對U251細胞遷移能力的影響

Transwell實驗結果顯示，轉染miR-192 mimics的穿膜細胞數為(83.20 ±21.51)個/孔，明顯少于miR-NC組[(126.33 ± 24.50)個/孔]，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

2.4 miR-192 mimics對U251細胞凋亡率的影響

兩組細胞的凋亡率經流式細胞術檢測，結果顯示，miR-192 mimics組和miR-NC組的細胞凋亡率分別為(18.23±1.86)%和(10.43±1.40)%，miR-192 mimics組的細胞凋亡率明顯高于miR-NC組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

圖4 兩組細胞Transwell實驗結果

注：A為miR-192 mimics組細胞；B為 miR-NC組細胞；C為兩組細胞凋亡率。

2.5 miR-192靶基因預測

利用miRWalk數據庫預測miR-192靶基因，并取Targetscan、miRanda、RNAhybrid、miRWalk和 Microt4數據庫的檢測結果取交集，部分靶基因詳見表1。選擇其中1個潛在靶基因SMC5，利用TargetScan、DIANA-microT和miRanda常用數據庫反向預測SMC5相互作用的miRNAs，顯示miR-192與SMC5的3'UTR區以不完全互補的方式結合。因此，SMC5可作為miR-192的靶基因以進一步分析。

3 討論

膠質瘤是顱腦內常見的惡性腫瘤，近年來其發病率及死亡率逐漸上升，即使經過手術切除治療，由于其惡性程度較高且血供豐富，術后復發率仍較高，生存時間較短，預后較差[7]。因此，尋找可靠的標志物和行之有效的干預靶點，是對膠質瘤的復發和轉移早診斷、早治療，進而改善膠質瘤患者預后的關鍵。miRNA是一類內源性非編碼RNA，通過結合特定mRNA 3'UTR端從而進一步調節靶基因的表達，廣泛參與體內的生理過程，其在腫瘤細胞如增殖、遷移、凋亡等生理病理進展的調控作用，也越來越受到重視[8]。miR-192定位于11號染色體，在胃癌、肺癌、膀胱癌等多種腫瘤中表達下調，且與腫瘤的遷移、侵襲等過程密切相關，是腫瘤抑制性miRNA[9]。本研究通過檢測miR-192在膠質瘤中的表達，并研究其對膠質瘤細胞增殖、遷移、凋亡的影響，生物學行為的影響，旨在為膠質瘤發生發展的分子機制和診療提供新的參考依據。

表1 利用miRWalk預測miR-192的部分靶基因

在肝癌HepG2細胞中，miR-192通過結合RBI mRNA 3'UTR端，負性調控RBI基因的表達，抑制肝癌中發揮重要作用[10]。細胞周期阻滯是抗腫瘤發生的重要機制，Georges等[11]通過研究發現，p53通過miR-192的激活，誘導細胞周期阻滯在G1/G2期，從而發揮抑癌作用。在結直腸癌中，miR-192過表達通過靶向細胞周期進程顯著降低細胞增殖，且癌細胞增殖減少和細胞周期停滯與P53的狀態有關，另外，miR-192的表達降低會影響結直腸癌細胞對5-氟尿嘧啶(FU)的敏感性改變[12]。在膀胱癌中，過表達MiR-192的細胞在G0/G1期表現出顯著增加，而在S期表現出顯著下降。此外，miR-192的過表達顯著誘導膀胱癌細胞凋亡，增加細胞周期蛋白p21，p27和Bax的水平，并降低細胞周期蛋白D1，Bcl-2和Mcl-1的水平[13]。因此，miR-192在多種腫瘤中發揮類似的抑癌作用[14]。本研究通過檢測miR-192在膠質瘤細胞核正常人腦膠質細胞中的表達，通過轉染miR-192 mimics 序列，上調miR-192的表達，并對U251細胞生物學行為進行檢測，結果發現，miR-192在膠質瘤細胞中的表達水平顯著低于人正常人腦膠質細胞，且經miR-192 mimics轉染后，U251細胞生長受到抑制，細胞克隆率明顯減少，且穿膜細胞數減少，表明miR-192在膠質瘤細胞中表達明顯下降，可顯著抑制膠質瘤細胞增殖和遷移。另外，經流式細胞術檢測，上調miR-192表達后，U251細胞凋亡率顯著提升，以上結果表明miR-192在膠質瘤中發揮抑癌作用，miR-192有可能作為治療膠質瘤的潛在靶點。

本研究利用miRWalk數據庫預測miR-192靶基因，并取Targetscan、miRanda、RNAhybrid、miRWalk和 Microt4數據庫的檢測結果交集，結果顯示SMC5可作為miR-192的靶基因。染色體結構維持(structural maintenance of chromosomes，SMC)蛋白是1種序列保守的染色體ATP酶，真核生物中有SMC1-6，共六種，其中SMC5通過結合SMC6形成SMC5-SMC6復合體，參與染色體復制中期結構形成、維持等動態變化，保障DNA重組和修復等過程順利進行，因而對細胞分裂過程中遺傳物質的準確復制和分離重要功能活動起重要作用[15]。因此，miR-192可能是通過調節SMC5的表達水平，影響細胞周期過程中染色體結構維持、遺傳物質的準確等過程，調控細胞周期的進程。

綜上所述，miR-192能夠抑制膠質瘤U251細胞的增殖、遷移并促進其凋亡，為膠質瘤的治療提供潛在靶點。miR-192可能通過靶基因SMC5發揮其對膠質瘤的調控作用。