細胞自噬在甲狀腺相關眼病中的作用

袁善思，劉 薇，馬 超，陳 蘭，李凱軍

0引言

甲狀腺相關眼病(thyroid-associated ophthalmopathy，TAO)，又稱Graves眼病，是一種可導致眼外肌、眼眶脂肪和結締組織炎癥的自身免疫性疾病[1]，是目前臨床上最常見的眼眶疾病[2]。其主要的臨床表現為眼球突出、暴露性角膜炎、特征性的眼瞼征及視神經壓迫等多方面，嚴重者可致盲[3]。TAO的發病機制極為復雜，其發病機制尚未完全闡明。有學者認為其發病機制主要涉及以下三個方面：炎癥、脂肪形成和糖胺多糖(glycosaminoglycans,GAG)聚集[4]。自噬存在于細胞內，它既是維持細胞正常生理學功能的基礎，也是細胞面對內外微環境刺激或壓力的一種防御方式[5]，具有非選擇性。自噬是一把雙刃劍，適當水平的自噬可以幫助機體抵御外部壓力，如機體通過在饑餓、化療、感染、衰老和缺氧等環境下提高細胞自噬水平來保護機體免受傷害，但過高的自噬水平則會使病情惡化，引起機體損傷[6]。自噬介導了細胞成分的降解，維持細胞內穩態所需的營養，促進細胞成分循環利用[7]。本文主要討論在TAO疾病中產生過度的自噬水平對疾病的影響。有研究表明[8-10]，自噬水平的升高在TAO的發生發展中起著重要作用，可導致眼眶炎癥增強、脂肪形成增多和GAG聚集。而適當降低自噬，可減弱眼眶炎癥、減少脂肪形成和GAG聚集，從而緩解TAO的發展。現將從眼眶炎癥、脂肪形成和GAG聚集三個方面討論自噬在TAO中的作用。

1自噬在TAO中的作用

自噬是一種高度保守的分解代謝過程，宿主細胞可以通過溶酶體降解蛋白質聚集物和受損的細胞器來維持細胞的穩態[11]。細胞發生自噬后，細胞漿中出現大量游離的膜性結構，稱為前自噬泡。前自噬泡逐漸發展，成為由雙層膜結構構成的空泡,包裹變性壞死的細胞器和部分細胞漿,這種雙層膜被稱為自噬泡。自噬泡的外膜與溶酶體膜融合后,內膜及其包裹的物質進入溶酶體,被溶酶體中的酶水解[12]。目前已研究出自噬有3種類型：巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬，其中巨自噬為最主要的類型。巨自噬形成具有特殊結構的自噬小體，以捕獲細胞內容物和目標蛋白。隨后，捕獲的細胞內容物和目標蛋白被包裹在自噬小體的胞質雙膜遞送囊泡中。接下來，自噬小體隨后與溶酶體融合，將內容物分解成可回收利用的大分子成分[13]。自噬途徑的調控主要包括三個大分子復合物：哺乳動物雷帕霉素靶點(mammalian target of rapamycin,mTOR)復合物、類UNC-51自噬激活蛋白激酶1(unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1)復合物和Beclin 1/PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)經典復合物(圖1)[14-16]。

研究表明[17]，自噬在TAO患者中的表達水平較非TAO患者高，且在甲狀腺相關眼病的發生發展中起著重要作用。IL-1β可以導致眼眶成纖維細胞中炎癥因子增加，而這種IL-1β引起的炎癥伴隨著自噬活動的增加，導致自噬相關蛋白Beclin-1和Agt-5表達增加，LC3-I到LC3-Ⅱ的轉化增強[8]。自噬也可以根據環境調節炎癥細胞因子的產生和分泌，如IL-6、IL-8、巨噬細胞移動抑制因子(MIF)和I型干擾素等[18]。長期的炎癥環境可導致膠原蛋白和糖胺聚糖沉積，導致組織擴張和纖維化[10]。除此之外，大量研究[19-21]表明自噬也參與脂肪形成。自噬水平增高會促進脂肪分化，異常增生的脂肪組織可直接導致眼眶壓力增高，眼球突出，不僅如此，脂肪組織還可作為一種新的內分泌器官，分泌多種脂肪細胞因子、生長因子及蛋白分子等，其中部分因子可能參與了TAO的發病過程[22]。因此，自噬在TAO的發生發展中起著十分重要的作用，對自噬進行合理的調節或可緩解TAO進程。

1.1自噬對TAO中炎癥的影響在TAO的發生發展過程中，T細胞在抗原的刺激下不斷地進行遷徙并高度增殖，分化成多種多樣的效應T細胞，如CD4+輔助T細胞(Th1/Th2/Th17)、CD8+T細胞、調節性T細胞(Treg細胞)等。T細胞通過雙重信號識別抗原并活化自身，活化后的T細胞分化形成效應T細胞發揮作用。Th1細胞因子在TAO早期起主導作用，促進了從早期炎癥向晚期慢性炎癥的過渡，晚期則出現Th2細胞因子富集[23]。除此之外，TAO患者的眼眶成纖維細胞可分泌IL-6、IL-8等炎癥因子，其炎癥因子的分泌水平明顯比正?；颊吒?；成纖維細胞與Th17細胞的相互作用促進了成纖維細胞的炎癥反應，而且它還能吸引Th17細胞，導致TAO的進一步惡化[24]。因此，炎癥在TAO的發病過程中起著重要作用。有研究表明[25]，自噬是控制免疫性炎癥的關鍵因素。Li等[8]研究表明，IL-1β刺激可引起眼眶成纖維細胞炎性細胞因子如圖1自噬通路圖。

IL-6、TNF-α、MCP-1的mRNA表達增加，這種IL-1β引起的炎癥伴隨著自噬水平的升高，自噬相關蛋白Beclin-1和Agt-5表達增加，LC3-I向LC3-Ⅱ轉化增多；用自噬抑制劑3-MA bafilomycin A1處理眼眶成纖維細胞，或沉默自噬相關蛋白Beclin-1、Atg-5可減弱IL-1β誘導的眼眶炎癥，而自噬激活雷帕霉素則導致眼眶成纖維細胞炎癥增強，該研究表明自噬水平與眼眶成纖維細胞的炎癥水平呈現相同的變化趨勢，黃芪甲苷Ⅳ可通過抑制自噬減弱TAO患者眼眶炎癥。因此，對自噬的合理調控可以減弱TAO患者眼眶炎癥，緩解疾病進程。

1.2自噬對TAO中脂肪形成的影響脂肪形成是TAO發病機制的重要過程，Nishida等[26]測量了TAO患者和正常人的眼眶，發現TAO患者的眼眶組織容量較正常人顯著增加，且眼眶脂肪組織的增加量明顯大于眼外肌的增加量，并在一定程度上決定了眼球的突出程度。不僅如此，脂肪組織還可作為一種新的內分泌器官分泌細胞因子，部分可能參與了TAO的發病過程[22]，因此，脂肪形成是TAO的重要發病過程。脂肪細胞的形成是一個多階段的過程，涉及前脂肪細胞的增殖、生長停滯和終末分化，是前脂肪細胞向成熟脂肪細胞的分化過程[27]。大量研究[19-21]表明脂肪形成的過程需要自噬參與。電鏡顯示，自噬體在脂肪分化的早期和中期大量形成，最終消失，細胞形態由長梭形變為球形，分化的后期，細胞質內形成脂滴[17]。動物實驗也表明：特異性敲除自噬基因atg5或atg7在白色脂肪組織中的表達可導致突變小鼠脂肪細胞形態異常、脂肪沉積減少[19-21]，通過對3T3-L1前脂肪細胞和小鼠胚胎成纖維細胞的體外研究也證明從遺傳和藥理學等方面抑制自噬可阻斷脂肪細胞分化，例如淫羊藿苷可通過抑制AMPK/mTOR通路的激活來抑制自噬，從而抑制前脂肪細胞向成熟脂肪細胞的分化。Li等[8]研究表明用自噬抑制劑處理，或沉默自噬相關蛋白Beclin-1和Atg-5，可顯著減少體外眼脂肪積聚、膠原沉積和體內巨噬細胞浸潤。

1.3自噬對TAO中GAG聚集的影響在眾多導致TAO患者眼球突出的因素中，GAG的聚集也是其重要原因之一[28]。根據其化學結構，GAG為重復的二糖單元組成的線性多糖，其以游離形式以透明質酸的形式存在，或者共價連接到蛋白多糖上。GAG的組成具體包括透明質酸(HA)、硫酸軟骨素(CS)、硫酸皮膚素(DS)、硫酸角質素(KS)、硫酸乙酰肝素和肝素[29]。炎癥浸潤學說認為，炎癥介質如IL-1、TNF-α、IFN-γ、TGF-β、IGF-1、PDGF(血小板衍生生長因子)和前列腺素可刺激眼眶成纖維細胞產生HA[28]。機械致病機制認為，TAO發病過程中的免疫性炎癥可導致眶內成纖維細胞增殖并產生大量的GAG，其主要成分為HA，后者吸水強,使眶內容物體積過度膨脹[30]。此外，HA的產生還與TAO成纖維細胞促甲狀腺激素受體(TSHR)的表達存在一定關系，在細胞功能模型中發現，TSHR可能介導活化眼眶成纖維細胞中的GD-IgG，GD-IgG可通過IGF-IR促進眼眶成纖維細胞生成HA[10]。對TAO患者的眶內組織學研究表明[31]，GAG主要聚集在眼眶脂肪和眼外肌結締組織成分中，這種聚集造成脂肪體積增大，而GAG在眼外肌結締組織內的積聚，也導致了眼外肌肌體明顯增粗。與此同時，GAG生成的增加和組織的水腫，增寬了眼眶結締組織的間隔。以上因素加劇了眼球被動向前移位，進而形成突眼。由于自噬水平與炎癥程度的密切相關性，因此，自噬對TAO中GAG聚集的影響可通過對炎癥的控制來實現。由此可見，對TAO患者自噬活性的合理調節可降低眼眶炎癥反應，從而減少GAG聚集，進而緩解TAO進程。

2其他發病機制研究

除了自噬對TAO的影響，有學者認為TAO是由甲狀腺和眼眶都表達的共同抗原導致的位點特異性自身免疫性疾病，并且以細胞免疫為主[32]。T淋巴細胞浸潤眼眶后，T細胞及其細胞因子可能通過激活B細胞，刺激自身抗體的產生，促進黏附分子的表達，產生炎性細胞因子等途徑參與TAO的發病[2]。不僅如此，這個過程所分泌的細胞因子可刺激成纖維細胞合成和分泌GAG，導致眼球突出等眼眶癥狀[33]。同時，TAO也被認為是由于通過TSHR介導的病原性抗體的作用所致的疾病[34]，Wakelkamp等[35]研究發現，TSHR mRNA在TAO患者眶減壓術的離體脂肪細胞中高表達，且與TAO患者的臨床活動度成正比。在TAO的發生過程中，TSHR與其他因子和信號分子之間的相互作用導致眼眶自身免疫反應，眼眶成纖維細胞增殖，前脂肪細胞分化為脂肪細胞，自身抗體產生，細胞因子分泌和眼外肌浸潤[10]。此外，有研究發現TAO患者心臟鈣固蛋白基因上調，提示自身對鈣固蛋白的免疫可能是TAO發病機制的觸發因素[36]。還有學者發現，TAO患者血清免疫球蛋白(IgG)可結合并激活眼眶成纖維細胞(OFs)中的胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)，認為IGF-1R參與了TAO的發病機制；隨后的研究還證明，IGF-1R也在免疫系統水平上發揮作用，并且在B細胞和T細胞以及單核細胞中都有表達；來自TAO患者的IGF-1RAbs可以誘發甲狀腺細胞和眼眶成纖維細胞釋放吸引T細胞的細胞因子[37]。

此外，遺傳和環境因素也在TAO的發生和發展中發揮著作用。在一項評估TAO、Graves病和橋本甲狀腺炎患者一、二級親屬眼部和眼瞼表現的研究中，33%甲狀腺功能正常的親屬存在上瞼退縮等TAO表現[38〗。吸煙、應激、感染、放射性碘治療、干擾素和白細胞介素治療等均可對TAO的發生與發展產生作用[39]。其中，吸煙是TAO的獨立致病因素，且發病風險與吸煙的數量呈正比，Kau等[40]研究發現，TAO的眼眶成纖維細胞對香煙煙霧提取物的刺激反應過度，造成氧化應激增加，纖維化相關基因表達，尤其是使結締組織生長因子以及細胞內轉化生長因子-β1和白細胞介素-1β水平升高。Cawood等[41]在體外TAO模型中證明，香煙提取物作用下，GAG的產生和脂肪生成以劑量依賴的方式增加。而與以往吸煙者相比，吸煙者的甲狀腺眼病嚴重程度取決于目前吸煙者每天吸煙的數量[42]。

3總結與展望

綜上所述，細胞自噬在TAO的發生發展中發揮著重要作用，適當降低自噬水平可減弱TAO患者眼眶炎癥、減少脂肪形成和GAG聚集，從而緩解TAO的進程。目前對自噬的研究多集中在其對炎癥和脂肪形成中的作用，對GAG聚集和成纖維細胞分泌的其他細胞外因子的影響報道尚少，如自噬對1型膠原蛋白分泌的影響等。自噬是一把雙刃劍，適當水平的自噬可以幫助機體抵御外部壓力，但自噬水平過高則會使病情惡化，對機體起損害作用。因此，對自噬活性的合理把握需要進一步研究。同時，纖維化也是TAO發病機制中的一部分，且自噬對纖維化作用報道也尚少。為此，我們期待對細胞自噬的深入研究可以為TAO提供新的診療思路。