視黃醇脫氫酶5在視覺周期和遺傳性視網膜疾病中的研究進展

毛玉梅，楊 琴，蘭長駿，廖 萱

0引言

視黃醇脫氫酶5(retinol dehydrogenase 5，RDH5)又稱11-順式視黃醇脫氫酶，屬于短鏈脫氫酶/還原酶家族，是視覺周期中一種關鍵的NAD(H)依賴氧化酶。在高等動物的視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞中，RDH5作為視黃醇脫氫酶家族的重要一員，以NAD(H)為輔助因子，主要參與氧化形成11-順式視黃醛(11-cisretinal，11cRAL)，最后與視蛋白結合形成視色素發色團，從而在視覺周期中扮演重要角色[1]。RDH5基因發生突變后導致酶的活性大幅下降，從而產生一系列生物學效應，甚至造成嚴重的視網膜病變。本文對RDH5基因及其編碼蛋白質的結構和功能，以及近年來RDH5在視覺周期和遺傳性視網膜疾病方面相關研究進展進行簡要綜述。

1 RDH5的結構和功能

在脊椎動物視覺周期過程中，11cRAL發色團通過質子化的schiff-堿基與視紫紅質共價結合后，被運輸到感光細胞。一旦接受光刺激，11cRAL與視紫紅質分離并異構化為全反式視黃醛(all-transretinal，atRAL)，激發視覺信號級聯反應[2]。RDH5可以催化11-順式視黃醇(11-cisretinol，11cROL)形成11cRAL[3]，參與眼內發色團的形成，也能作為主要的限速酶在其他部位將9cROL氧化為9cRAL，在第一步的限速反應中發揮作用[4]。RDH5可以在視覺周期不同種類的視黃醇氧化過程中發揮重要作用，既有助于11cROL氧化成為視覺周期的發色團，進一步誘發光電信號的轉化，也可以促進視黃酸的形成。了解此酶的結構以及與其他周期蛋白之間的相互作用可以加深對視循環過程的理解。

1.1 RDH5的結構RDH5作為短鏈脫氫酶/還原酶(short-chain dehydrogenases/reductases，SDRs)家族中首個被鑒定和克隆的視黃醇脫氫酶，主要分布在眼的RPE層[5]。視黃醇脫氫酶類代表了SDRs家族結構特征，具有典型的Rossmann折疊(3～4條α螺旋位于中心，被平行的6～7條β折疊包圍)，也包括兩個保守區域：(1)N末端的輔因子結合位點，富含甘氨酸的序列(G-X-X-X-G-X-G)；(2)位于C端的具有催化活性中心的四分體N-S-Y-K[6-7]。不同類型的視黃醇脫氫酶所處的細胞器位置、N末端和/或C末端的結構域并不完全一致。

1.2 RDH5的功能RDH5是一種膜蛋白酶，通過氨基末端信號錨定肽和羧基末端跨膜段錨定在內質網膜和微粒體膜，催化結構域面向管腔內側。近年來發現內質網膜內側腔隙中的NAD(H)是RDH5的輔助因子，是其有效氧化視黃醇的必要條件[7]。除了輔助因子NAD(H)，還應考慮底物(9/11cROL、類維生素A)的生理濃度，二者從細胞質到管腔的擴散和轉運必須通過跨膜，才能最終實現酶促反應，但是如何介導該過程的動力學還需要進一步探索。也有研究表明RDH5是一個膜拓撲結構，是由18個氨基酸殘基組成的N端疏水螺旋、蛋白中部疏水螺旋-環螺旋跨膜區以及靠近C端的23個氨基酸殘基的疏水螺旋體構成，形成膜錨定蛋白[8]。目前對于RDH5的拓撲結構仍存在爭議。

2 RDH5與視周期蛋白的相互作用

RDH5在細胞中的流動性以及與其他視周期蛋白之間的交互作用提示酶之間和酶與蛋白之間并不是獨立發揮作用，而是相互聯系來共同促進視覺循環。

Sahu等[7]最初通過免疫共沉淀的方法發現RDH5與RPE65之間存在交互，二者可以耦合形成復合物。RPE65蛋白在RPE細胞中高表達，分布在胞質膜和內質網膜胞漿一側[9]，主要參與類維生素A的代謝過程，如視黃醇攝取、代謝和異構化。也有研究表明這種異構酶可以將全反式視黃醇酯轉化為11cROL。人類RPE65基因的突變會導致萊伯氏先天性黑朦，在嬰兒期出現致盲[9-10]。但目前二者間交互作用的機制仍然是未知的。

Chen等[11]發現了與RDH5相互作用的另一種蛋白，視網膜G蛋白偶聯受體(retinal G protein-coupled receptor，RGR)，其結構類似于視覺色素以及其他G蛋白偶聯受體的蛋白質，與視色素主要集中在錐體外段，提示這些視色素之間可能存在相互作用[12]。作為光異構酶，RGR在視覺色素的通用發色團11cRAL產生中發揮重要作用，主要是通過與atRAL生色團結合，使其光異構化為11cRAL[13-14]。此外，研究發現在穆勒膠質細胞中的RGR視蛋白也參與視色素的再生，可以和RDH10在可見光下將所有atROL轉化為11cROL[15]。RDH5將11cROL氧化為11cRAL，增強了RGR結合的atRAL的凈光異構化[11]。同時有研究證明RGR的作用不僅可以防止9c/13cRAL異構化，也可以直接或間接地除去這些同分異構體[15]。RDH5與RGR的相互作用有可能僅表現在視循環中。

Ward等[13]和Saari等[16]發現在11cRAL再生過程中，細胞視黃醛脫氫酶結合蛋白(cellular retinaldehyde-binding protein，CRALBP)和RDH5關系密切。CRALBP是一種可溶性的胞漿蛋白，可以作為關鍵的底物載體，介導11cROL從異構酶中轉移到RDH5，并催化11cROL氧化為11cRAL，從而促進11cRAL的生成[17]。此外，研究揭示了CRALBP與RDH5和磷酸化蛋白50(ERM-binding phosphoprotein 50，EBP50)/鈉氫交換調節因子1(sodium-hydrogen exchanger regulatory factor type 1，NHERF1)的相互關系[16,18]。RDH5催化反應發生在RPE細胞頂端突起中視覺周期蛋白復合體[18-19]。該復合物由CRALBP和EBP50/NHERF1兩種蛋白構成，有助于靶蛋白的頂端定位，為類維生素A加工提供了結構基礎[20]。EBP50/NHERF1又與埃茲蛋白(ezrin)相互作用，后者與各種胞質膜成分結合，并與肌動蛋白細胞骨架物理連接[21]。提示該復合物與RDH5結合可能有助于RPE頂端的11cRAL局部合成和釋放。

在視覺周期過程中，RDH5作為一種關鍵限速酶，參與形成發色團，促進光化學信號的轉變。同時，不同的酶和蛋白也參與了該反應，協同RDH5催化氧化，在時間和空間上都大大增加了酶促反應，這也是從暗適應快速轉換到明適應的重要基礎。但RDH5與其他視蛋白或酶之間如何相互作用調控類維生素A的儲存和轉換還有待進一步研究。

3 RDH5突變與遺傳性視網膜病變

RDH5基因位于染色體12q13.2，包含5個外顯子，編碼含318個氨基酸的蛋白，分子量約為32kDa。大部分RDH5基因的突變會改變內質網腔室的催化結構、N末端或C末端的膜錨定蛋白和活化區域等主要功能區，進而嚴重影響RDH5的功能，延遲視錐細胞和視桿細胞感光色素的再生，導致眼部尤其是遺傳性視網膜疾病的發生，如白點狀眼底(fundus albipunctatus，FA)、視網膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)、白點狀視網膜炎(retinitis punctata albescens，RPA)。

3.1 RDH5突變與白點狀眼底多數FA病例是由RDH5基因突變引起的。FA是一種靜止型先天性夜盲癥，主要遺傳方式是常染色體隱性遺傳，其主要特征是除黃斑區以外，視網膜中周部彌散分布典型的淡黃色斑點。RDH5突變的FA患者突變點主要集中在編碼區，這類患者主要表現為視桿功能異常，部分RDH5基因突變的FA患者還出現黃斑萎縮或視錐細胞營養不良等臨床表現，特別是老年患者[22-23]。Sergouniotis等[24]在8個先天性夜盲癥家系的9例FA患者中，檢測出9個RDH5純合突變或復合雜合突變，其中錯義突變33 Ile→Thr、19 Arg→Gly、116 Gly→Arg、139 Gly→Val、237 Tyr→Ser以及插入突變p.Arg54_55ValinsAla均會改變內質網腔室的催化胞外域，而錯義突變319 X→Arg是翻譯終止位點突變，導致原本短小的胞漿序列延長；剪接突變c.320+1G>A以及移碼突變p.Arg275fsX60突變點位于C段跨膜結構域的序列，改變了跨膜蛋白的長度。這些外顯子編碼區的突變位點影響了蛋白轉錄和翻譯，對FA患者眼部形態和功能均產生了不同程度的影響。全視野視網膜電流圖(full-field electroretinography，ffERG)結果顯示全部患者視桿反應減少，其中6例患者出現視錐反應異常；而隨著暗適應時間延長，部分患者視桿反應恢復正常，提示著一種替代現象。此外，基因敲除的動物模型[25]驗證了RDH10也能低效率地促進11cROL氧化成11cRAL，與視紫紅質結合從而參與明暗適應的轉換。Makiyama等[26]通過自適應光學掃描激光眼底鏡也證實FA患者的視錐功能下降，伴隨著黃斑周圍的視錐細胞密度減少、空間排列紊亂。

Ajmal等[23]研究了巴基斯坦2個FA家系的潛在遺傳分子機制，在其中一個家系中發現位于最后一個外顯子突變缺失5個堿基，導致RDH5基因開放閱讀框的移碼(p.Val305Hisfs*29)，將第305位的纈氨酸替換為組氨酸，終止密碼的位置變為第29位，最終使蛋白的C端跨膜結構域縮短；在另一家系中發現新的錯義突變253 Met→Arg，該位點在正常人高度保守，突變后導致核心蛋白錯誤折疊，蛋白與蛋白之間的疏水作用喪失。4例FA患者因RDH5突變位點不同而表現出眼底白點伴或不伴有黃斑萎縮、RPE變性和錐桿反應降低的臨床癥狀，顯示同一家系內相同突變點出現表型異質性。青少年患者黃斑功能正常，而較年長患者均出現了黃斑萎縮，提示黃斑變性可能是FA患者一種進行性的并發癥。表型異質性是一個不確定因素，突變類型本身不是決定是否出現并發癥的唯一因素，仍需要進一步探究基因型-表型之間的關系。

另有研究發現，FA的RDH5基因突變位點c.928delCinsGAAG在日本人群中長期存在。Katagiri等[27]在22個日本家系的25例FA患者中檢測到RDH5基因突變以c.928delCinsGAAG最多見，其中12例患者因c.928delCinsGAAG純合突變致病，推測是遺傳漂變作用的奠基者效應。92%患者的年齡均為40～78歲，67%患者的視錐反應下降，50%患者有黃斑病變。攜帶該奠基者效應突變的FA患者中，年輕患者的視錐功能和視桿功能尚存；一旦患者的年齡超過40歲，黃斑功能會逐漸喪失，這也是導致該突變位點的表型不穩定的重要因素。Yang等[28]和Liu等[29]對中國人群RDH5基因突變導致FA的研究發現，RDH5基因的熱點突變c.928delCinsGAAG(310 Leu→GluVal)導致幼齡患者視桿功能尚存、視錐功能正常，其他患者出現了表型異質性。根據人類基因突變數據庫(The Human Gene Mutation Database，HGMD)數據顯示，該突變位點突變頻率高達75%，該變異的編碼蛋白第310位非極性亮氨酸突變為極性谷氨酸和非極性纈氨酸，二級結構由α螺旋轉變為β折疊，這使得原來的膜錨定結構無法正常固定在膜上[30]。

3.2 RDH5突變與視網膜色素變性研究也發現RDH5編碼區的突變與RP相關。一項6代大家系的研究鑒定出了一種新的RDH5突變位點(201 Ser→Phe)，該突變改變了內質網腔的催化區域，導致了感光細胞變性或凋亡，臨床主要表現為眼底色素沉著、視盤蠟樣蒼白、外核層厚度減少，進行性夜盲，最終導致視野狹窄和失明[31-32]。目前國內僅報道過1例RDH5基因突變導致RP。王春霞等[33]鑒定1個FA與RP共存家系，發現新突變(c.689_690CT>CG)位于第4外顯子，發生突變后的CG因失去限制性內切酶的識別位點導致無法被切斷，翻譯后的結構蛋白喪失了完整的催化結構域，最后導致眼底出現骨細胞樣色素沉積，ffERG的a波和b波振幅均顯著性下降，且不會隨著暗適應時間變化而改善，視錐和視桿功能嚴重喪失，為典型的RP表現。當RDH5基因突變位點改變酶的催化結構域或活化中心時，將會大大降低酶的活性，這類患者的表型會更加嚴重。

3.3 RDH5突變與白點狀視網膜炎RPA是一種更為嚴重的廣泛性視網膜變性疾病，主要是視網膜多個白點沉積、小動脈進行性衰減和視野縮小、ffERG嚴重降低，且不會隨著暗適應時間的延長而恢復。RPA是一種罕見的先天性進行型夜盲癥，目前RDH5基因突變與RPA的報道較少。最近，Khan等[34]報道2個近親家庭中發現了RDH5突變導致RPA。2個家系所有RPA患者的全外顯子測序發現位于RDH5第1外顯子/內含子邊界的一個新的剪接變異體(c.-33+2dup)，該突變點導致第1內含子被保留而改變了第1外顯子的開放閱讀框序列，影響了N末端膜錨定蛋白片段的功能，最終該蛋白無法介導其他酶的轉運。2個家系中7例純合突變患者均表現出典型的RPA特征，ffERG結果顯示出視桿反應完全喪失，視錐功能嚴重減弱；攜帶1個雜合子的患者眼底也出現少量白點沉積。需重視RDH5突變的RPA患者的表型評估和鑒別診斷，對于癥狀較輕和體征不明顯的攜帶者也不容忽視。

4結論和展望

RDH5作為一個關鍵酶在視覺周期中發揮著重要作用，不僅可以協同其他周期蛋白參與視覺周期中視色素的形成，也促進生成視黃酸進而調控靶細胞的增殖和分化等。RDH5蛋白的跨膜結構域、催化結構域、活化區域等主要功能區域均已發現突變位點，并導致了不同的遺傳性視網膜疾病表型。目前研究對RDH5基因突變位點的識別和補充，擴展了遺傳性視網膜病變的基因診斷譜系，有助于疾病早期篩查和風險評估等。隨著研究的不斷深入，有望開發出用于治療RDH5突變相關遺傳性視網膜疾病的基因替代和靶向分子藥物，進行精準的生物治療和靶向治療，從而控制疾病發展和改善預后，最終達到治愈相關疾病和提高生存質量的目的。