電子煙對小鼠視網膜組織及超微結構影響的研究

年 申，喬妮妮，羅阿麗，李 娟，王善偉，米亞靜，張光偉

0引言

吸煙對身體的多個器官造成不同程度的影響，是世界上老年人死亡的重要原因之一。近年來電子煙以戒煙、清肺等為宣傳口號,在全球快速流行，獲得了越來越多的消費者青睞[1]。電子煙(又稱電子尼古丁傳送系統，Electronic nicotine delivery systems,ENDS)由電池(供電系統)、霧化器(霧化系統)和液體(電子煙霧化液)構成[2-3]。電子煙霧化液在加熱后氣化并向開口端噴出,噴出的蒸汽在大氣中冷凝，形成類似于傳統香煙煙霧的微小霧滴被吸食者吸入[4]。有文獻報道[5-6]電子煙煙液可能含有有毒成分,如有害金屬、甲醛、丙烯醛等,對人體健康產生影響。文獻報道吸煙與許多眼部疾病密切相關，其主要是通過氧化應激或缺氧機制造成視網膜的損傷,但電子煙與眼部疾病的關系鮮有報道，本文旨在探討小鼠在被電子煙煙霧染毒后小鼠視網膜各層組織病理學變化、視網膜色素上皮(RPE)細胞超微結構改變及其與氧化應激之間的關系，為臨床上防治相關視網膜疾病提供一定的理論依據。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物選取18只c57BL雄性小鼠(8周齡，體質量18～22g，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供)，均為無特定病原體級實驗動物(SPF級動物)。使用裂隙燈顯微鏡及眼底鏡檢查小鼠眼前節、眼底未發現異常。整個實驗中，18只小鼠均置于標準環境飼養:室溫25℃±1℃，濕度60%±10%和交替的12h明暗周期(早上8點到晩上8點)，并給予相同的水量和食物[7-8]。動物實驗符合視覺與眼科協會規定的對于動物眼科和視覺研究的使用要求(動物處死采用水合氯醛過量麻醉后處死，僅使用動物的一只眼球用于實驗)，同時獲得了西安交通大學醫學院動物倫理委員會的批準。

1.1.2電子煙特唯普(Truvape，英國)。

1.1.3儀器與試劑模擬人體呼吸系統吸煙的仿生裝置(專利201721438419.0)，靜式染毒柜(中國天津合普)，光學顯微鏡(Olympus BX41)，透射電子顯微鏡(HitachiHT 7800)，激光共聚焦顯微鏡(Thermo Celllnsight CX5),石蠟切片機(徳國Leica RM2235)，圖像分析系統(Leica Q550CW)，Anti-beta Ⅲ Tubulin antibody(英國Abcam,1∶1000)，8-OHdG(美國Santa Cruz,1∶1000)，Goat Anti-Mouse lgG H&L(英國Abcam,1∶500)，蘇木素(Sigma)。

1.2方法

1.2.1動物模型建立本研究應用仿生模擬人體呼吸系統吸煙發生裝置模擬人體吸煙行為習慣，按人20支/天吸煙量(每根煙含12mg尼古丁)計算,依小鼠體表面積換算需要電子煙煙液的量。通過發明專利裝置，將電子煙煙霧傳送至靜式染毒柜，每天2次，每次染毒30min,持續12wk。

1.2.2動物分組18只c57BL小鼠隨機分為A組、B組和C組。A組為對照組(6只),不做特殊處理，B組為0mg尼古丁電子煙組(6只)，C組為12mg尼古丁電子煙組(6只)。B組和C組進行電子煙煙霧干預，每天2次，一次30min。干預12wk后，處死小鼠，摘取眼球。

1.2.3小鼠視網膜結構觀察各組小鼠水合氯醛(100g/L)腹腔麻醉,處死小鼠后取眼球，將小鼠眼球分別固定于40g/L多聚甲醛溶液內[9]。依次經體積分數為80%(1min，2次)、95%(3min，2次)、100%(5min，2次)乙醇逐級脫水，浸蠟，石蠟包埋并切片(片厚4μm)。部分經過視神經切片行HE染色,于光學顯微鏡下觀察視網膜各層結構的改變并測量每張切片中央部視網膜全層、視神經纖維層、內叢狀層的厚度；隨機選取5張切片并求得平均值作為該眼球的中央部平均視網膜、視神經纖維層、內叢狀層厚度。其余經過視神經切片行免疫熒光染色。

1.2.4視網膜Tuj1和8-OHdG免疫熒光染色各組石蠟切片脫蠟后,Proteinase K(20μg/mLPBS)15min修復抗原,用免疫熒光封閉液封閉60min,Tuj1、8-OHdG一抗4℃孵育過夜,羊抗小鼠二抗室溫避光孵育1h,含DAPI的封閉液封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。用細胞圖像分析系統計數節細胞層Tuj1陽性細胞數，隨機選取5張切片并求得平均值作為該眼球的平均節細胞層Tuj1陽性細胞數。

1.2.5視網膜色素上皮細胞超微結構觀察將3組小鼠眼球標本分別置于體積分數2.5%戊二醛前固定2～4h,洗滌，10g/L鋨酸固定1～2h,洗滌；乙醇梯度脫水、環氧樹脂滲透、包埋與聚合、切片，枸櫞酸鉛和醋酸雙氧鈾雙重染色，于透射電子顯微鏡下觀察RPE細胞的超微結構并拍照[10]。

2結果

2.1小鼠視網膜結構觀察對照組小鼠視網膜形態正常,各層結構完整,層次分明。內界膜(internal limiting membrane,ILM)清晰完整;視神經纖維層(nerve fiber layer，NFL)神經纖維排列較好；神經節細胞層(ganglion cell layer，GCL)內細胞核多呈卵圓形,在中央部排列成假復層,周邊部呈單層排列，較密集，可見多個毛細血管；內叢狀層(inner plexiform layer，IPL)結構較完整；內核層(inner nuclear layer，INL)細胞核排列整齊，染色均勻，約5～6層；外叢狀層(outer plexiform layer，OPL)和外核層(outer nuclear layer，ONL)細胞核排列整齊、緊密，有一定極向性；外界膜(external limiting membrane,ELM)、視錐視桿細胞(rods and cones)和RPE層均形態正常，RPE層細胞呈矮立方狀單層排列,細胞漿內含色素(圖1A)。0mg尼古丁組測得小鼠視網膜厚度178.8±6.92μm,內界膜較完整，局部不清晰；視神經纖維層神經纖維部分改變、消失，排列不規則；視神經節細胞層內細胞核為卵圓形,部分形態異常,排列紊亂，染色不均一,疏密不一，局部可見細胞核的缺失，毛細血管較對照組減少；內叢狀層結構較好，內核層細胞核排列較規則，外叢狀層、外核層、外界膜、視錐視桿細胞和視網膜色素上皮層均未見明顯改變(圖1B)。12mg尼古丁組各層結構改變與0mg尼古丁組基本一致(圖1C)。3組小鼠視網膜厚度、視神經纖維層厚度和內叢狀層厚度見表1。三組間視網膜厚度、視神經纖維層厚度和內叢狀層厚度比較，差異有統計學意義(F=44.65，P<0.0001；F=56.64，P<0.0001；F=24.42，P<0.001)。0mg和12mg尼古丁組視網膜、視神經纖維層和內叢狀層厚度與對照組相比均顯著變薄(P<0.01)，但是0mg和12mg尼古丁組之間差異無統計學意義(P=0.3716、0.7201、0.5369)，見圖2～4。

圖1 三組小鼠視網膜HE染色情況(×400) A：正常對照組；B：0mg尼古丁電子煙干預；C：12mg尼古丁電子煙干預。

圖2 三組小鼠視網膜厚度的比較 A組：正常對照組；B組：0mg尼古丁電子煙干預；C組：12mg尼古丁電子煙干預。b P<0.001 vs A組。

圖3 三組小鼠視神經纖維層厚度的比較 A組：正常對照組；B組：0mg尼古丁電子煙干預；C組：12mg尼古丁電子煙干預。b P<0.001 vs A組。

圖4 三組小鼠內叢狀層厚度的比較 A組：正常對照組；B組：0mg尼古丁電子煙干預；C組：12mg尼古丁電子煙干預。b P<0.001 vs A組。

表1 三組小鼠視網膜、視神經纖維層和內叢狀層的厚度

2.2小鼠視網膜Tuj1免疫熒光染色Tuj1可以與神經細胞中Ⅲ類β-微管蛋白特異性結合，因此常作為視網膜神經節細胞的標志。本實驗將在GCL層的Tuj1和DAPI雙染的細胞定義為視網膜神經節細胞。對照組小鼠視網膜神經節細胞排列緊密有序,大小相似，胞漿內可見強的紅色免疫熒光信號,視神經纖維層和內叢狀層也可見紅色免疫熒光信號(圖5A、D)；0mg尼古丁組神經節細胞排列紊亂，疏密不一,胞漿內可見較強的紅色免疫熒光信號，視神經纖維層紅色免疫熒光信號較弱,內叢狀層內也可見紅色免疫熒光信號(圖5B、E)；12mg尼古丁組紅色免疫熒光信號強弱與0mg尼古丁組相似(圖5C、F)。對照組、0mg尼古丁組和12mg尼古丁組神經節細胞數目(85.5±2.38、81.75±2.63、81±3.16個/毫米)無明顯差別，差異無統計學意義(F=3.089，P=0.0952，圖6)。

2.3小鼠RPE細胞超微結構改變RPE細胞位于Bruch膜上,對照組RPE細胞內可見黑色素顆粒,細胞頂部可見十分豐富的細長微絨毛(圖7A)；0mg尼古丁組RPE細胞內仍可見黑色素顆粒，但是細胞頂部微絨毛數量明顯減少，僅可見零星的微絨毛，殘存的微絨毛長度變短(圖7B)；12mg尼古丁組RPE細胞超微結構的改變與0mg尼古丁組相似(圖7C)。

2.4小鼠視網膜8-OHdG免疫熒光染色正常組小鼠視網膜內偶爾在神經節細胞層內見到核呈淡紅色的8-OHdG免疫熒光信號，其余各層未見明顯陽性表達(圖8A、D)。實驗組(0mg尼古丁組和12mg尼古丁組)小鼠視網膜GCL內可見多個核漿著色的較強紅色8-OHdG免疫熒光信號,內核層內可見較弱紅色8-OHdG免疫熒光信號，其余各層未見明顯陽性表達(圖8B、C、E、F)。

3討論

近年來電子煙因具有戒煙、清肺的宣傳作用，且具有與傳統香煙相近的外觀、煙霧、味道和吸食口感而被消費者青睞[6]。Farsalinos等[11]對20種電子煙煙液與傳統香煙煙氣的體外毒性效應進行分析表明，電子煙煙液的細胞毒性均小于傳統香煙煙氣，但仍有毒性影響，可能主要與煙液內添加的香味成分有關。Bahl等[12]報道不同電子煙煙液的細胞毒性差距很大，Behar等[13]則進一步證明電子煙煙液造成的細胞毒性與其內的肉桂添加劑有關。有研究證實[14],電子煙煙液可致小鼠肺、膀胱等器官DNA損傷。傳統香煙與視網膜相關疾病如年齡相關性黃斑變性有密切關系，但電子煙是否也會造成視網膜病理改變并繼而引發相關疾病卻鮮有報道。

圖5 三組小鼠視網膜Tuj1(紅色)和DAPI(藍色)染色情況(×200) A,D：正常對照組；B,E：0mg尼古丁電子煙干預；C,F：12mg尼古丁電子煙干預。三角指示在神經纖維層Tuj1的染色，箭頭指示視網膜神經節細胞。

圖6 三組小鼠視網膜神經節細胞數目的比較 A：正常對照組；B：0mg尼古丁電子煙干預；C：12mg尼古丁電子煙干預。

圖7 三組小鼠視網膜色素上皮細胞頂部微絨毛的改變(×4000) A：正常對照組；B：0mg尼古丁電子煙干預；C：12mg尼古丁電子煙干預。

視網膜是一層柔軟而透明的膜,緊貼在脈絡膜內面，可以感受光的刺激。視網膜從外向內分為10層，分別為色素上皮層(由單層色素上皮細胞構成)、視桿視錐層(由視桿細胞和視錐細胞的外突構成)、外界膜(由Müller細胞的外突末端連接而成)、外核層(由視桿細胞和視錐細胞的細胞體組成)、外叢狀層(由視桿細胞和視錐細胞的內突及雙極細胞的樹突構成)、內核層(由雙極細胞、水平細胞、無長突細胞和Müller細胞的胞體構成)、內叢狀層(由雙極細胞的軸突和無長突細胞及節細胞的樹突構成)、節細胞層(由節細胞的胞體組成)、神經纖維層(由節細胞的軸突組成)、內界膜(由Müller細胞的內突末端連接而成)。有研究顯示在慢性吸煙人群中神經纖維層的厚度明顯減少[15]，在本實驗中我們也觀察到類似的結果，即兩個實驗組的神經纖維層厚度較對照組明顯減少，這說明電子煙也可能對視網膜造成與傳統煙相似的損傷。但是三組小鼠視網膜神經節細胞層內細胞數量無明顯統計學差異，我們推測可能是由于個體間神經節細胞層內細胞數量的差異較大造成的[15]。但值得關注的是我們觀察到實驗組內叢狀層厚度較對照組明顯減少，有研究表明內叢狀層厚度的變化可一定程度反映神經節細胞數量的變化[16]，雖然如前所述三組間神經節細胞數量無明顯統計學差異，但是實驗組的神經節細胞較對照組明顯紊亂，這一現象也許和內叢狀層厚度減少有關,這還需在后續的實驗中進一步探討。

視網膜色素上皮層與脈絡膜相連，是由單層色素上皮細胞構成，排列十分規則。RPE細胞位于視網膜感光細胞層和Bruch膜之間,底部緊鄰Bruch膜，由一層六面柱狀單層細胞組成，是血-眼屏障和血-視網膜外屏障的主要組成部分，有一定的抗氧化能力,在維持視網膜微環境和保護視網膜中神經元等方面起到了一定的作用。Masashi等的研究表明傳統煙煙霧會造成小鼠視網膜RPE細胞超微結構的改變，這與年齡相關性黃斑變性的發生密切相關[17]。在我們實驗中，RPE層組織病理學觀察未見明顯變化，電子顯微鏡下我們觀察到兩個實驗組小鼠RPE細胞頂部微絨毛數量顯著減少且排列不規則,殘存的微絨毛結構也被破壞，長度變短，說明電子煙對于RPE細胞的超微結構同樣具有損傷作用，提示電子煙也可能與年齡相關性黃斑變性的發生有關。

吸煙會增加氧化應激的水平,香煙煙霧中的化學氧化劑會引起蛋白質、DNA和脂質的氧化損傷[18-21]。有大量證據表明DNA氧化損傷與吸煙的影響關系密切，氧化損傷的核苷也隨著時間增加而在細胞核和線粒體DNA中積累[22]。8-OHdG是核苷2’-脫氧鳥苷的氧化形式,是DNA的氧化產物,它是一個很好的標記DNA氧化損傷的指標[23]。Higuchi等報道經過香煙煙霧作用后，大鼠角膜內8-OHdG可以表達上調，但是電子煙煙霧對于人體甚至視網膜的影響作用鮮有報道，在本實驗中我們觀測到8-OHdG在視網膜(節細胞層和內核層)的陽性表達,也能反映電子煙煙霧對于視網膜有一定的氧化損傷作用[24]。煙草中最主要的生物堿-尼古丁會導致視網膜血管收縮，造成缺氧，引起血管內皮生長因子上調，從而誘發新生血管的形成[25]。另外，尼古丁還可以引起氧化應激反應，在RPE細胞內產生大量自由基，損傷線粒體，最終導致RPE細胞凋亡[25-26]。在本實驗中，我們觀察到0mg尼古丁組和12mg尼古丁組之間在視網膜組織結構、RPE超微結構以及氧化損傷指標上沒有明顯差異，這提示電子煙引起的損傷不僅僅是尼古丁的單獨作用，而應該是由煙油中各種有害物質的疊加作用所形成的。

圖8 三組小鼠視網膜8-OHdG(紅色)和DAPI(藍色)染色情況(×200) A,D：正常對照組；B,E：0mg尼古丁電子煙干預；C,F：12mg尼古丁電子煙干預。箭頭指示為在神經節細胞層和內核層中8-OHdG染色陽性的細胞。

綜上所述，電子煙可以對小鼠視網膜組織結構和RPE細胞在超微結構上造成改變,同時節細胞層、內核層均觀察到8-OHdG表達增加，我們推測可能是電子煙干預所引起的視網膜氧化應激反應。但由于我們的干預時間較短，還未造成顯著的不可逆損傷，未引起明顯的組織病理學改變。這些研究結果將為我們后期進一步探究電子煙對視網膜的長期影響以及相關機制提供一定的研究基礎，進一步科學評價電子煙對機體的影響，積極尋求有效研究方法，為臨床診療提供科學依據。