兔干眼細胞模型的建立與生物學特征評價

李 玲，朱夢晨，李 點，楊婷婷，邱 婷，王 健

0引言

隨著現代生活計算機、手機的普及，外界環境風沙、煙塵的侵襲，隱形眼鏡和冷暖空調的廣泛使用，干眼的發病率呈逐年升高趨勢[1-2]。因此，對干眼發病機制與藥物防治的研究具有重要的現實意義。基于淚腺細胞原代培養構建穩定的干眼細胞模型成為本課題組研究的首要工作，然而，干眼細胞模型雖有報道，但不盡詳細，模型的穩定性也有待考究，不利于以原代淚腺細胞為工具的相關的基礎和臨床研究。因此，本研究使用原代培養兔淚腺上皮細胞，采用脂多糖(LPS)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)干預的方式構建干眼細胞模型，并通過免疫熒光、流式和ELISA方法，對原代細胞進行活性和純度檢測，并對比兩種建模方式的差異，為進一步篩選干眼防治藥物和評價藥效學奠定基礎。

1材料和方法

1.1材料新西蘭白兔，雄性，12只，90日齡，1～1.2kg，普通級，由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供(SPF級)。湖南許可證號：SCXK(湘)2013-0004。飼養溫度20～25℃，濕度50%～70%。所有動物實驗操作均經過湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會審議并通過。流式細胞儀(美國Beckman，coulter-cytexpert)，細胞培養箱(美國Thermo，3111)，臺式高速冷凍離心機(美國Thermo)，ELX800-酶標儀(美國Bio-tek，ELX800)，微量移液器(德國Eppendorf)；FBS、DMEM/F12的培養液購自美國Gibco，Ⅱ型膠原酶(V900892)、LPS(Sigma，L2880)，TNF-α因子(美國Immunochemistry，6519)，Pan-cytoeratin抗體(bs-1712R)、FITC-羊抗兔IgG(bs-0370R)、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(BA00101)、CCK-8細胞增殖-毒性檢測試劑盒(Biosharp，BS350A)。

1.2方法

1.2.1完全培養液的配置取10mL FBS、40mL DMEM/F12基礎培養基混合，配成含20%FBS的DMEM/F12完全培養液。Ⅱ型膠原酶：0.01gⅡ型膠原酶粉溶于基礎培養基中定容至5mL，配制成2g/L應用液。

1.2.2淚腺上皮細胞的原代培養[3-4]隨機選取1只雄兔，選用20%烏拉坦1.5g/mL耳緣靜脈注射，在超凈工作臺上常規無菌操作，用眼科剪取出淚腺組織。置于培養皿中用含雙抗的PBS清洗兩遍，換成DMEM/F12基礎培養基，剝離小血管及纖維結締組織，并剪碎淚腺小組織塊，整個過程在冰上操作。轉移至15mL BD管中，1500r/min，離心5min去上清，加入5mLⅡ型膠原酶，置于搖床80r/min消化20～30min后加入完全培養液終止消化。1500r/min離心5min，棄部分上清，加入5mL 0.25%胰蛋白酶后于培養箱消化5min。終止消化后進行吹打并吸走絮片狀組織塊，經200目篩網過濾，1500r/min，離心5min去上清。加入含20% FBS的DMEM/F12完全培養基，制備細胞懸液。細胞按(4～6)×104cells/mL的密度接種于培養瓶，常規培養，12h后換液，以去除沒有貼壁的細胞及碎片。此后每12h換液一次。

1.2.3免疫熒光法檢測Pan-cytoeratin蛋白取第二代細胞，接種于預置在12孔板的爬片上，當細胞基本融合，及時取出作4%多聚甲醛固定30min。冷0.01mol/L PBS洗5min×3次，5%BSA封閉30min后，每孔加入一抗兔源Pan-cytoeratin(1∶200)50μL，4℃孵育過夜。PBS洗爬片5min×3次，吸水紙吸干多余液體后加入FITC標記抗兔IgG(1∶200)，室溫避光孵育1h，棄液，PBS洗5min×5次。細胞骨架羅丹明(1∶100)染色，避光孵育20min，棄液，PBS洗5min×5次。滴加DAPI(1∶200)避光孵育5min，棄液，PBS洗5min×8次。防熒光淬滅劑封片。檢測淚腺上皮細胞特異性蛋白Pan-cytoeratin表達情況。

1.2.4干眼細胞模型[5]根據LPS和TNF-α的IC50值，結合預實驗結果，分別選取LPS(10μg/mL)和TNF-α(2.5ng/mL)作為干預淚腺細胞的施加因素，干預12h后，處理細胞，收集樣本，對相關炎性因子的細胞損傷關鍵元件進行檢測，擬構建淚腺細胞的炎癥微環境，模擬干眼的生物學特征，同步設空白對照組。

1.2.4.1藥物IC50的測定淚腺細胞接種于96孔板(6000cells/well)。分別用不同濃度(0、5、10、20、40μg/mL)的LPS和TNF-α(0、2.5、5、10、20ng/mL)孵育12h。根據試劑盒說明書，使用CCK-8測定細胞毒性。在450nm處測量光密度(OD)。根據光密度(OD)計算細胞抑制率IR(%)=(對照-干預)/(對照-空白)×100%，以及IC50。選取半數IC50值作為干預濃度。

1.2.4.2流式細胞術檢測各組細胞的凋亡情況淚腺原代細胞接種于6孔板(10000cells/well)中，采用上述細胞模型建立的不同干預方式處理12h后，收集各組細胞，按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書，使用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

圖1 兔淚腺上皮原代細胞提取與培養 A：兔淚腺取材；B：兔淚腺上皮原代細胞鏡下觀察(×40)；C：兔淚腺上皮原代細胞鏡下觀察(×100)。

圖2 兔淚腺上皮原代細胞標志蛋白Pan-cytoeratin的表達(×200) A:合成B+C+D；B：FITC標記Pan-cytoeratin蛋白；C：DAPI標記細胞核；D：羅丹明標記細胞骨架。

圖3 LPS和TNF-α干預兔淚腺原代上皮細胞12h的IC50 A:LPS的IC50;B：TNF-α的IC50。

1.2.4.3 ELISA檢測各組細胞上清液中相關炎性因子的含量淚腺原代細胞接種于6孔板(8000cells/well)中，采用上述細胞模型建立的不同處理方法，收集各組細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書，測定白細胞介素1β(IL-1β)和白細胞介素6(IL-6)的含量。

2結果

2.1兔淚腺上皮原代細胞培養情況原代培養12h后細胞基本貼壁，48h可見細胞形態舒展，呈長三角形。待細胞增殖至覆蓋培養瓶70%～80%時進行胰蛋白酶消化傳代。用CCK-8法檢測細胞活性，達92%以上，見圖1。

2.2免疫熒光法檢測兔淚腺上皮原代細胞標志蛋白Pan-cytoeratin的表達免疫熒光結果顯示：兔淚腺上皮原代細胞標志角化蛋白(Pan-cytoeratin)主要表達在細胞質，且陽性率>90%，符合實驗要求,見圖2。

2.3 LPS和TNF-α的IC50結果CCK-8結果顯示：LPS和TNF-α干預兔淚腺上皮細胞12h的IC50分別為20μg/mL、4.996ng/mL，擬后續兩種方法制備兔干眼細胞模型時，選擇LPS的0.5倍，即10μg/mL和TNF-α的0.5倍IC50，即2.5ng/mL進行后續實驗，見表1,圖3。

表1 不同濃度LPS和TNF-α干預兔淚腺原代上皮細胞的抑制率

2.4流式細胞術檢測各組細胞的凋亡情況流式細胞術結果顯示：三組細胞凋亡率比較，差異有統計學意義(F=225.30，P<0.01)。LPS(10μg/mL)和TNF-α(2.5ng/mL)組細胞凋亡率明顯高于空白對照組，差異具有統計學意義(t=12.34，P<0.01；t=16.53，P<0.01)。兩種造模干預組組間比較，TNF-α組細胞凋亡率高于LPS組，差異具有統計學意義(t=4.18，P<0.01)，提示TNF-α模擬干眼的炎癥反應效果優于LPS，見表2，圖4。

圖4 兩種干預方式細胞凋亡情況的比較 A：空白對照組；B：LPS組；C：TNF-α組；D：各組凋亡率比較。b P<0.01 vs空白對照組;d P<0.01 vs LPS組。

表2 各組細胞凋亡率和細胞上清液中IL-1β、IL-6的含量比較

2.5 ELISA檢測各組細胞上清液中炎性因子的含量ELISA結果顯示：三組細胞上清液中IL-1β和IL-6的含量比較，差異有統計學意義(均P<0.01)。LPS(10μg/mL)和TNF-α組(2.5ng/mL)細胞上清液中IL-1β和IL-6的含量均明顯高于空白對照組，差異具有統計學意義(P<0.01)。兩種造模干預組組間比較，TNF-α組IL-1β和IL-6的含量明顯高于LPS組，差異具有統計學意義(P<0.01)，提示TNF-α模擬干眼的炎癥反應效果優于LPS，見表2。

3討論

干眼是眼表的一種多因子疾病，特征是淚膜穩態的喪失并伴有眼表癥狀，其病因包括淚膜不穩定、淚液高滲性、眼表炎癥與損傷和神經感覺異常，其中淚腺上皮炎癥浸潤和病變是干眼的重要病理生理過程[6-7]。近幾年有研究發現，眼表的慢性炎癥是干眼重要的病理機制[8]。人體內的炎癥因子如TNF-α具有免疫調節、參加炎癥反應的功能，生理狀態下炎癥因子表達較低[9],當分泌量加大時，能夠激活單核細胞和中性粒細胞，促進白細胞聚集，誘發機體產生一系列炎癥反應[10]。炎癥在延續和維持干眼中起著關鍵作用[11]。因此，通過離體兔淚腺并分離淚腺上皮細胞作為研究干眼的對象，有助于在體外模擬干眼。

本研究中兔淚腺上皮細胞的體外基礎培養基為DMEM/F12，含有更為豐富的營養成分和多種微量元素，并加以15%～20%的FBS，能盡可能模擬體內機體環境，有利于細胞的生長和代謝。本研究對獲取的兔淚腺上皮細胞進行活性和純度檢測結果顯示：兔淚腺上皮原代細胞標志角化蛋白(Pan-cytoeratin)主要表達在細胞質，且陽性率>90%，符合實驗要求。

目前研究表明，干眼發生的主要機制為炎癥反應、細胞凋亡等，眾多炎癥細胞因子、促炎因子的交互作用參與了干眼的發病過程[12-13]。常規細胞炎癥模型的干預方法以LPS刺激為主，LPS是革蘭氏陰性菌細胞外膜的主要成分，與其受體結合后啟動細胞內信號傳遞鏈，促使核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)活化，從而啟動炎癥介質、黏附分子等轉錄，介導炎癥反應[14]。而TNF-α是干眼炎癥反應中活躍的炎癥因子，通過激活NF-κB通路誘導炎癥介質的產生，介導細胞凋亡。我們前期研究也證實兔干眼動物模型血清和淚腺組織勻漿液中TNF-ɑ表達與正常組差異最為顯著，而且干眼患者淚液中TNF-α的含量與角膜上皮的損傷程度呈正相關[15]，由此可推測，在一定程度上TNF-α干預淚腺上皮細胞更具備干眼模型的特征。因此，本研究采用LPS和TNF-α構建干眼模型，并對兩者構建干眼模型的IC50，細胞凋亡和炎性因子分泌等進行檢測和比較，結果表明LPS和TNF-α干預兔淚腺上皮細胞12h的IC50分別為20μg/mL和4.996ng/mL，兩者的0.5倍IC50，即10μg/mL和2.5ng/mL干預下細胞凋亡和炎性因子分泌水平TNF-α高于LPS。由此可見，LPS和TNF-α皆可以構建干眼模型，但是在相同IC50的干預下，TNF-α的造模效果優于LPS。

本研究成功建立了一種細胞純度較高、相對簡便、快速，模型穩定的兔干眼細胞模型，為兔淚腺上皮細胞功能及干眼的基礎研究提供了更穩定的體外實驗模型。