吡非尼酮對內皮細胞間質轉化的抑制作用及機制

廖丁瑩，付麗麗，鄭玉萍，王麗君，李宏松，張文怡，王建明，趙 琳

0引言

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)是一種常見的視網膜變性疾病，主要發生于50歲以上的中老年人群。近20a來，ARMD的患病率已經達到8.7%[1]。濕性ARMD是以黃斑區脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)為主要特點，異常的新生血管會引起出血和滲出，使黃斑部感光細胞功能減退，甚至造成纖維瘢痕化和視網膜脫離，視力永久性喪失[2]。目前一線治療方法為玻璃體腔注射抗血管內皮生長因子(VEGF)類藥物治療，抑制或減少新生血管的形成及出血滲出。但是隨著該類藥物的廣泛應用和隨訪時間的延長，視網膜下纖維化逐漸加重的情況日益突顯。有文獻指出在CNV疾病中，血管內皮細胞是新生血管和纖維化過程中多因素作用的關鍵細胞，脈絡膜微血管內皮細胞符合內皮細胞的特有表型[3]。內皮細胞在各種刺激因子的作用下，其內皮特性逐漸消失而轉化為間質細胞(endothelial-to-mesenchymal transition，EndoMT)，最終導致纖維化，形成視網膜下瘢痕[4]。目前普遍認為缺氧會使轉化生長因子-β(TGF-β)水平升高，TGF-β又是刺激EndoMT發生的最常見的因子，同時也會引起下游纖維化因子增多[5]，進一步加重視網膜下纖維化的程度。

吡非尼酮(Pirfenidone，PFD)是一種新型的廣譜抗纖維化小分子化合物，其主要作用靶點是TGF-β，可有效抑制纖維細胞增殖和細胞外基質沉積[6]，已成為治療肝、腎及心肌纖維化的一線藥物。但PFD是否能夠延緩CNV患者視網膜下纖維化的進展尚未見報道。本研究初步觀察PFD對缺氧誘導內皮細胞EndoMT過程的抑制作用及機制，探討PFD延緩視網膜下纖維化的可行性。

1材料和方法

1.1主要試劑和儀器M199培養基(Gibco)，胎牛血清(BI)，內皮細胞生長因子(ScienCell)，吡非尼酮(Sigma)，CoCl2(Sigma)，CCK-8(索萊寶)，Trizol(Invitrogen)，反轉錄和PCR試劑盒(TaKaRa)，PCR引物(生工)，BCA蛋白定量試劑盒(赫特)。電泳儀、電轉儀和發光儀(Bio-Rad)，實時熒光定量PCR儀(Step One Plus)；熒光成像顯微鏡(Zeiss)。

1.2方法

1.2.1原代人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)分離及培養標本取自于西安交通大學第二附屬醫院婦產科正常剖宮產的新生兒無菌臍帶，約25～30cm，置于無菌保存液中轉運。本研究標本取材獲得西安交通大學第二附屬醫院倫理委員會審批[No.(2019)倫審-研第(021)號]。在超凈臺內用滅菌PBS緩沖液反復沖洗臍靜脈內部以除去凝血塊及殘留物，預熱至37℃的0.1% Ⅰ型膠原酶10mL灌入臍靜脈內，夾閉臍帶兩端，37℃消化10min，期間不時地晃動臍帶使膠原酶Ⅰ充分接觸靜脈內壁。消化結束后回收消化液至離心管內，室溫下800×g離心5min得到臍靜脈內皮細胞，加入含20%胎牛血清的M199培養基，吹打混勻種于培養皿內，置于37℃、5% CO2細胞培養箱內培養，24h后換液。待內皮細胞生長融合至80%～90%時，用0.05%胰蛋白酶消化傳代，經vWF因子抗原實驗鑒定確認原代細胞分離成功，選第4～7代細胞用于后續實驗。

1.2.2原代HUVECs鑒定免疫熒光法檢測vWF因子抗原。將細胞均勻接種于置有滅菌爬片的24孔板內，生長至約50%時，PBS緩沖液清洗后加入4%多聚甲醛冰上固定30min，PBS緩沖液洗滌后加入0.1% Triton-X100溶液，室溫破膜20min，小牛血清室溫封閉1h，加入兔抗人vWF因子抗體(Abcam，ab154193，1∶300)，4℃過夜，再加入488nm熒光素標記的羊抗兔二抗(CST，#4412，1∶800)室溫孵育1h，DAPI室溫作用20min后，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖活力將細胞每孔100μL均勻接種于96孔板中，根據參考文獻[7]的濃度梯度，待細胞貼壁后加入不同濃度PFD(0、0.01、0.1、0.3、0.6、0.9mg/mL)或CoCl2(0、25、50、100、200、400、800μmol/L)，分別孵育不同時間(12、24、48h)后，每孔加入10μL CCK-8工作液，培養箱內孵育4h，取出后測定各孔在450nm處的吸光度(OD)值，計算細胞增殖率，細胞增殖率=(OD實驗組-OD空白)/(OD對照組-OD空白)×100%，篩選出合適的藥物濃度和作用時間。

1.2.4實驗分組將細胞隨機分為4組：(1)正常對照組：不含CoCl2和PFD的無血清培養基培養細胞24h；(2)CoCl2模型組：含200μmol/L CoCl2的無血清培養基培養細胞24h；(3)CoCl2+低濃度PFD組：含0.3mg/mL PFD的無血清培養基預處理1h，再用含200μmol/L CoCl2和0.3mg/mL PFD的無血清培養基共同培養細胞24h；(4)CoCl2+高濃度PFD組：含0.6mg/mL PFD的無血清培養基預處理1h，再用含200μmol/L CoCl2和0.6mg/mL PFD的無血清培養基共同培養細胞24h。收集細胞用于后續實驗。

1.2.5 Western blot實驗檢測蛋白質相對表達量收集各組細胞，提取細胞總蛋白，BCA法測定各組蛋白濃度，與上樣緩沖液混合后高溫煮10min。在聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)中電泳，使用濕轉的方法將蛋白質轉移至激活的PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1h。按照目標蛋白的分子量裁膜，分別加入上皮標志物CD31(Santa Cruz，sc-376764，1∶500)、VE-cadherin(Abcam，ab33168，1μg/mL)，纖維細胞標志物α-SMA(Abcam，ab5694，1μg/mL)、FSP1(Abcam，ab197896，1∶1000)，通路因子p-p38(ABclonal，AP0057， 1∶1000)、p38(ABclonal，A4771，1∶1000)和內參GAPDH(Proteintech，60004-1-lg，1∶25000)抗體，4℃過夜，TBST洗膜后分別加入羊抗兔(Elabscience，E-AB-1003，1∶3000)、羊抗鼠(Elabscience，E-AB-1001，1∶3000)二抗，室溫孵育1h，洗膜后加入ECL顯色液后曝光拍照。

圖1 原代HUVEC細胞的形態及鑒定 A：光鏡(×40)；B：光鏡(×100)；C：vWF因子熒光染色(×200)。

1.2.6細胞免疫熒光雙染法檢測蛋白表達情況細胞隨機均勻種于鋪有無菌爬片的24孔板中，貼壁后各組分別加入相應藥物進行干預，24h后4%多聚甲醛冰上固定30min，PBS緩沖液洗滌后加入0.1% Triton-X100溶液，室溫破膜20min，小牛血清室溫封閉1h，滴加鼠抗人CD31(Abcam，ab24590，1∶150)和兔抗人α-SMA(Abcam，ab5694，1∶100)混合抗體，4℃過夜，洗滌后分別滴加種屬對應的594nm(Proteintech，SA00013-3，1∶250)和488nm(CST，#4412，1∶800)熒光二抗，避光室溫孵育1h，洗滌后DAPI避光染色20min，洗滌后封片。鏡下拍照觀察。

1.2.7細胞劃痕實驗觀察細胞遷移能力預先在六孔板背面畫出定位線，細胞隨機均勻種于各孔，貼壁后用200μL槍頭垂直于定位線畫出劃痕，按照分組分別加入相應藥物進行干預，每孔于劃痕后0、24h在顯微鏡下觀察并拍照。細胞遷移率=(0h劃痕距離-24h劃痕距離)/0h劃痕距離×100%。

1.2.8實時定量q-PCR檢測mRNA含量按各個分組進行培養干預后收集細胞，使用Trizol法提取細胞總RNA，分光光度計測定純度和濃度后，逆轉錄為cDNA，采用20μL體系進行擴增，PCR反應條件為：94℃預變性2min，1個循環，94℃變性20s，60℃退火30s，72℃延伸20s，循環40次。TGF-β1引物序列：5’-CAGCAACAATTCCTGGCGATA-3’，5’-GCTAAGGCGAAAGCCCTCAAT-3’；SNAI1引物序列：5’-TCGGAAGCCTAACTACAGCGA-3’，5’-AGATGAGCATTGGCAGCGAG-3’；β-actin引物序列：5’-TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC-3’，5’-GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3’。反應結束后根據擴增曲線結果，采用2-ΔΔCt法計算各目標基因的相對表達量。

統計學分析：本實驗的統計學分析采用SPSS 25.0軟件進行。所有實驗均重復3次。計量數據用均數±標準差表示，各組之間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1原代HUVECs細胞鑒定接種24h后，鏡下可見內皮細胞貼壁，呈梭形或橢圓形，邊界清晰。第4～6d，內皮細胞單層生長融合成片，排列緊密的部分呈典型的鋪路鵝卵石樣(圖1A、1B)。熒光顯微鏡下可見內皮細胞胞漿內均有亮度較強的綠色熒光，說明人vWF因子存在于細胞內，證明上述方法分離HUVECs細胞成功，且純度可達95%以上，可用于后續實驗(圖1C)。

2.2不同濃度CoCl2和PFD對HUVECs的增殖活力影響

篩選CoCl2誘導缺氧建立纖維化模型的最佳作用時間和濃度。結果如圖2A所示，隨著CoCl2作用時間和濃度的增加，細胞的增殖率逐漸下降，24h時各組細胞的增殖活力均在50%左右，對照組、25、50、100、200、400、800μmol/L CoCl2組的增殖率分別為(100±0)%、(83.48±9.11)%、(79.52±10.00)%、(69.72±11.78)%、(59.05±7.40)%、(44.75±10.69)%、(38.17±4.97)%，各組之間差異有統計學意義(F=39.52，P<0.01)。與對照組相比，100、200、400、800μmol/L組差異有統計學意義(t=6.298、13.56、12.66、30.54，均P<0.001)，表明CoCl2會導致內皮細胞缺氧，降低增殖率，具有一定的濃度依賴性。200μmol/L CoCl2干預細胞24h后增殖率略大于50%，故本實驗使用200μmol/L CoCl2刺激細胞24h建立細胞模型。

篩選PFD最佳治療時間和濃度。結果如圖2B所示，不同時間不同濃度PFD組分別與對照組、DMSO組相比，細胞增殖率基本不受影響(F12h=0.418，F24h=0.289，F48h=0.240，均P>0.05)，表明使用DMSO溶解PFD不會產生細胞毒性，且單純使用PFD不會對內皮細胞增殖產生影響。

圖2 CoCl2和PFD對內皮細胞增殖率的影響 A：CoCl2對細胞增殖率的影響(a P<0.05，b P<0.01 vs 對照組)；B：PFD對細胞增殖率的影響；C：PFD對缺氧條件下細胞增殖率的影響(b P<0.01 vs 對照組；d P<0.01 vs 單純缺氧組)。

不同濃度PFD預處理內皮細胞1h后，再加入200μmol/L CoCl2，使其共同干預刺激細胞24h，結果如圖2C所示，對照組、單純缺氧組、0.01、0.1、0.3、0.6、0.9mg/mL PFD組細胞增殖率分別為(100±0)%、(60.81±5.23)%、(59.4±5.90)%、(60.81±7.23)%、(72.45±6.30)%、(75.85±6.21)%、(79.7±4.94)%，差異有統計學意義(F=13.1，P<0.001)。與對照組相比，單純缺氧組細胞增殖率降低(t=13.8，P<0.001)；與單純缺氧組相比，經0.3、0.6、0.9mg/mL PFD溶液預處理后細胞增殖率明顯增加，差異有統計學意義(t=3.478、4.534、6.427，均P<0.01)。故后續實驗使用200μmol/L CoCl2和0.3、0.6mg/mL PFD共同干預細胞。

2.3 PFD對缺氧誘導的EndoMT過程中細胞遷移能力的影響各組細胞遷移率分別為(100±5.34)%、(332.63±10.37)%、(183.97±13.27)%、(204.75±9.40)%，差異有統計學意義(F=129.4，P<0.001)。正常對照組細胞形態規則，24h后劃痕邊緣整齊光滑，仍清晰可見；CoCl2模型組細胞劃痕邊緣在24h時基本消失，細胞向劃痕區域遷移，狀態不佳，變形及死亡的細胞數量增多；CoCl2模型組與正常對照組相比，缺氧后內皮細胞遷移能力增加(t=38.87，P=0.0007)。經低濃度或高濃度PFD溶液預處理后，兩組細胞的形態較CoCl2模型組改善，兩組間細胞遷移率差異無統計學意義(t=3.369，P=0.078)，但與模型組對比遷移率均明顯減小(t=88.41、16.29，均P<0.01)。證明PFD可抑制缺氧對內皮細胞遷移運動的增強作用(圖3)。

2.4 PFD對缺氧誘導的EndoMT過程中各標志物蛋白及mRNA表達的影響PFD可抑制EndoMT過程中間質細胞標志蛋白的表達和增加內皮細胞標志蛋白的表達。與正常對照組相比，CoCl2模型組細胞的α-SMA、FSP1的蛋白表達水平顯著升高(t=5.328、4.706，均P<0.05)，CD31、VE-cadherin的蛋白表達水平降低(t=6.379、5.78，均P<0.05)；與CoCl2模型組比較，低濃度PFD組和高濃度PFD組均能顯著抑制α-SMA、FSP1的蛋白表達，使CD31、VE-cadherin的蛋白表達仍維持在一個較高的水平(均P<0.05)，但組間差異無統計學意義(均P>0.05)，見圖4，表1。

PFD可抑制EndoMT過程中轉錄因子及通路因子的表達。與正常對照組相比，CoCl2模型組中p-p38磷酸化蛋白被激活(t=7.382，P<0.05)，經高低濃度PFD干預后，p-p38蛋白的磷酸化過程被抑制(t=4.667、9.392，均P<0.05)，p38總蛋白含量不變(P>0.05)，圖5A、5B，表1。

q-PCR實驗結果顯示，CoCl2模型組細胞中TGF-β1、轉錄因子SNAI1 mRNA含量較正常對照組明顯升高(t=14.46、9.89，均P<0.05)；與CoCl2模型組相比，低濃度和高濃度PFD組能明顯抑制TGF-β1、轉錄因子SNAI1 mRNA轉錄(均P<0.05)，且兩組間差異無統計學意義(均P>0.05)，見表2，圖5C。

細胞免疫熒光雙染檢測結果顯示，各組細胞CD31和α-SMA的表達差異具有統計學意義(F=105.6、33.42，均P<0.001)。與正常對照組相比，CoCl2模型組細胞CD31紅色熒光強度顯著變弱(t=18.02，P<0.01)，α-SMA綠色熒光強度增加(t=24.26，P<0.01)；與CoCl2模型組比較，低濃度和高濃度PFD組細胞α-SMA綠色熒光強度均被抑制(t=7.403、4.935，均P<0.05)，CD31紅色熒光強度增加(t=10.09、4.394，均P<0.05)；低濃度和高濃度PFD組相比，α-SMA和CD31熒光強度無明顯差異(t=1.021、1.152，均P>0.05)，見圖6。

圖3 PFD對缺氧條件下內皮細胞遷移能力的影響 A：光鏡下各組遷移距離的測量(×40)；B：各組遷移率的定量分析。b P<0.01 vs 正常對照組；d P<0.01 vs CoCl2模型組。

圖4 PFD對缺氧條件下內皮細胞EndoMT過程中相關標志蛋白表達量的影響 A：內皮細胞標志因子(CD31、VE-cadherin)和間質細胞標志因子(α-SMA、FSP1)的蛋白表達檢測條帶；B：各標志因子蛋白表達的定量分析。a P<0.05 vs 正常對照組；c P<0.05 vs CoCl2模型組。

表1 各組細胞中CD31、VE-cadherin、α-SMA、FSP1、p-p38和p38蛋白條帶灰度值

表2 各組細胞中TGF-β1和SNAI1 mRNA表達情況

3討論

眼底新生血管性疾病對視力產生影響的原因主要有活動性新生血管的出血滲出和新生血管萎縮后形成的纖維化組織。目前抗VEGF治療主要針對的是減少新生血管的生成及出血滲出，而對血管萎縮后的纖維化改變關注較少。Pedrosa等[8]對接受抗VEGF連續治療的ARMD患者展開60mo的隨訪觀察，發現有55.69%的隨訪者出現了較嚴重的黃斑部視網膜下纖維化。雖然纖維化是新生血管的必然結局，但是多次抗VEGF治療會破壞血管新生和纖維化之間的平衡，和自然病程共同引起過度的纖維增殖[9]。多項研究證實在各種因素刺激下，內皮細胞可通過TGF-β、Notch、Wnt等信號通路在心臟、肺和腎組織中發生EndoMT[10]。目前視網膜下纖維化的研究多集中于視網膜色素上皮細胞的上皮間質轉化(EMT)，而脈絡膜微血管內皮細胞的內皮間質轉化(EndoMT)則關注較少。

圖5 PFD對缺氧條件下內皮細胞EndoMT過程中轉錄因子及通路因子表達的影響 A：通路標志因子(p38、p-p38)的蛋白表達檢測條帶；B：p38、p-p38蛋白表達的定量分析；C：通路標志因子TGF-β1和轉錄因子SNAI1 mRNA表達的定量分析。a P<0.05，b P<0.01 vs 正常對照組；c P<0.05，d P<0.01 vs CoCl2模型組。

圖6 PFD對缺氧條件下內皮細胞中CD31和α-SMA表達的影響 A：各組細胞CD31和α-SMA的免疫熒光雙染結果(×200，CD31為紅色熒光，α-SMA為綠色熒光)；B：CD31和α-SMA的免疫熒光強度定量分析。b P<0.01 vs 正常對照組；c P<0.05，d P<0.01 vs CoCl2模型組。

缺氧是導致ARMD疾病發展的一個重要因素，缺氧會促進新生血管的發生，而血管的生長則使缺血進一步加重，使脈絡膜微血管內皮細胞進入EndoMT過程，引起視網膜下纖維瘢痕形成，所以尋找抑制視網膜下纖維化的方法顯得尤為重要。由于人脈絡膜微血管內皮細胞很難獲得，HUVECs是從人臍帶靜脈血管中分離培養的原代細胞，是研究新生血管及其后期進展的重要體外細胞模型，在視網膜及脈絡膜新生血管的研究中也廣泛應用[11]，故本研究使用HUVECs作為細胞模型。首先，本研究利用CoCl2誘導內皮細胞缺氧，建立纖維化模型。實驗中觀察到內皮細胞在缺氧環境中遷移能力增強，形態由鋪路鵝卵石樣逐漸變為狹長梭形，細胞之間的緊密連接變松散，間隙增大，內皮細胞標志物CD31和VE-cadherin表達減少，間質細胞標志物α-SMA和FSP1表達增多，說明該缺氧模型可以成功誘導EndoMT的發生。

既往研究證實PFD在腎、肺和肝臟等器官中可以減少促纖維和促炎癥因子的分泌和表達，如TGF-β、TNF-α，從而抑制細胞的間質轉化和膠原蛋白產生[12]。眼部的新生血管形成和纖維化均與TGF-β有關[13]。Martin等[14]學者發現患者接受抗VEGF藥物治療后，玻璃體腔中TGF-β含量增加，與后期纖維化顯著相關。本研究通過CCK-8法檢測了不同濃度PFD對內皮細胞增殖的影響，結果顯示PFD可明顯抑制缺氧細胞的增殖，其濃度為0.3、0.6和0.9mg/mL時均有效果，且組間無明顯差異，考慮到0.9mg/mL濃度較高，可能會引起藥物副作用，故后續實驗藥物濃度選擇0.3、0.6mg/mL。實驗中各濃度PFD對正常內皮細胞的增殖無明顯影響，主要是因為在正常視網膜脈絡膜組織中，TGF-β處于無活性的“潛活狀態”，當視網膜脈絡膜組織受到缺血、缺氧、炎癥等損傷時，可以激活TGF-β[15]，使其可以發揮促進纖維細胞增殖、減少細胞外基質降解等纖維化改變，此時PFD可以有效抑制這些生物學效應。

本研究對缺氧誘導的內皮細胞給予PFD治療后，光鏡下觀察治療組的細胞形態比單純缺氧組的形態更圓潤，細胞間隙較小，細胞邊緣突起減少，比較接近正常內皮細胞的形態。通過劃痕實驗可以觀察到PFD組的細胞遷移能力較單純缺氧組弱。與單純缺氧組相比，PFD組的內皮細胞標志物CD31和VE-cadherin的蛋白質表達增多，間質細胞標志物α-SMA和FSP1的蛋白質表達減少。上述改變在高低濃度PFD組間沒有顯著差異。由此證實了PFD可抑制內皮細胞向纖維細胞轉化的EndoMT過程，且該抑制作用對PFD濃度的差異不敏感，可以說明0.3～0.6mg/mL均為細胞治療窗，PFD的有效濃度范圍較大，該有效濃度與Guo等[7]報道的用于抑制Tenon囊成纖維細胞增殖遷移時的濃度相同。

近年來，TGF-β/Smad通路被認為是促進纖維化的經典信號通路。除此之外，多種Smad非依賴性信號通路可以被TGF-β激活[16]。Choi等[17]驗證了PFD通過TGF-β/Smad通路抑制纖維化的發生。有研究已經證明TGF-β能夠通過p38 MAPK信號通路促進眼部各組織多種細胞的新生血管生長和瘢痕化[18]。本研究發現缺氧的內皮細胞中TGF-β1和轉錄因子SNAI1 mRNA轉錄水平顯著增高，p-p38磷酸化蛋白被激活，而加入PFD干預后可以抑制這些因子的轉錄增加以及p-p38磷酸化蛋白的激活，初步提示PFD抑制EndoMT過程是通過TGF-β/p38 MAPK通路進行的，這對PFD可以延緩視網膜下纖維化的效果及機制提供了更充分的理論依據。

綜上所述，PFD可以有效抑制內皮細胞纖維化的進展，TGF-β/p38 MAPK通路可能是PFD調控內皮細胞向纖維細胞轉化EndoMT過程的機制之一，這可以成為PFD抗視網膜下纖維化的理論基礎，但該作用在眼內的實際效果，則需要更進一步的動物實驗論證。