干細胞的研究進展和應用前景

王 澤, 宋 揚, 秦林偉

(沈陽師范大學 生命科學學院, 沈陽 110034)

干細胞(stem cell,SC)是指在一定條件下具有無限自我更新增殖和限制性分化能力的一類細胞,它們能產生表現型和基因型與自己完全相同的子細胞,也能分化為某種特化細胞或祖細胞。按照來源可以分為胚胎干細胞(embryonic stem cell,ESC)和成體干細胞(adult stem cell),按照分化潛能可分為全能干細胞(totipotent stem cell)、多能干細胞(pluripotent stem cell)和單能干細胞(monopotent stem cell)。ESC是典型的全能干細胞,有形成完整個體的分化潛能;間充質干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)和誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cell,IPSC)為多能干細胞,具有產生多種類型細胞的能力,但是無法發育成完整的個體。3種干細胞在細胞移植、再生醫學、組織工程、毒性評價、神經退行性疾病治療等領域的應用價值日益凸顯,并有望在疾病治療中替代傳統的藥物治療,已經成為干細胞應用領域的研究熱點。

1 胚胎干細胞的研究與應用

1.1 胚胎干細胞的建系

胚胎干細胞是源于早期胚胎或原始性腺的一類全能性干細胞,具有典型的特征性表面標志物如糖脂類SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4及蛋白多糖類TRA-1-60, TRA-1-81, GCTM2等,是ES建系鑒定、質量評價及污染判定的標準。傳統的ESC培養多采用以骨髓間充質干細胞、毛囊間充質干細胞、小鼠胚胎成纖維細胞等為主的有飼養層培養體系,目前,ES的無血清無飼養層培養體系[1]、無動物源性培養體系[2]、懸浮培養體系[3]等培養模式得到了廣泛的探討。ESC建系多來自動物的桑椹胚、囊胚等胚胎組織,常用的分離方法有免疫外科法、機械分離法、酶消化法和單卵裂球法等。1981年首次成功分離獲得小鼠ES細胞,1988年Thomson等在建立靈長類動物恒河猴ES細胞系的基礎上,成功建立人的ES細胞系。目前,已分離獲得了倉鼠、大鼠、兔、豬、牛、綿羊、山羊、水貂、恒河猴、美洲長尾猴等ES細胞。此外,Kim[4]通過激活小鼠卵母細胞的方法,分離得到了與受體免疫系統組織相容的胚胎干細胞系。劉佳等[5]利用孤雌激活的小鼠囊胚建立了2種形態和生物學特征極其接近ES的細胞系Pa-AFSCs和Ja-ASCs,極大地推進了胚胎干細胞的醫療應用進程。

1.2 胚胎干細胞的誘導分化

理論上,ESC可以被誘導分化為3個胚層的所有細胞類型。目前,人ESCs(hESCs)可以人工誘導分化為滋養層細胞、神經細胞、神經膠質細胞、造血細胞、心肌細胞等。由于ESCs在能量代謝、物質代謝和大分子合成方面具有獨特的生理特征,ESCs的生長、自我更新和分化譜系等受到其培養環境、細胞因子、營養物質等因素的影響顯著,如高水平的蛋氨酸代謝對于小鼠胚胎干細胞(mESCs)維持自我更新和多能性至關重要,蛋氨酸代謝水平降低可以促進mESCs向3個胚層分化[6];體外培養基中加入BMP4, Activin A, BGFG和VEGF可以定向誘導mESCs向造血細胞和血管內皮細胞分化[7];單獨增加Activin A能夠顯著促進hESCs向神經外胚層細胞的分化。Park等[8]發現MAGEA2下調會引起mESCs發生多能性標志基因表達的降低、S期細胞周期阻滯、caspase依賴的凋亡等生物學事件。利用shRNA抑制mESCs多梳家族蛋白PHC1的活性,可以上調mESCs定向分化為心肌細胞的分化效率[9]。mESC-PA6共培養的條件培養液可以顯著增強mESCs的神經分化[10]。ESCs的定向誘導研究對于了解ESC的多能性、自我更新和系統分化等生物學過程和分子機制具有重要的科學價值。

1.3 胚胎干細胞的應用

胚胎干細胞現已成為研究早期胚胎發育途徑、疾病預防和藥物毒性的有力工具。臨床級別的hESC細胞系Q-CTS-hESC-2在非xeno條件下可分化成視網膜色素上皮細胞,在濕性黃斑的損傷區域可檢測到rpe樣細胞層的存在[11]。hESCs經過定向誘導可分化為更接近髁突軟骨的細胞[12],為實現髁突軟骨的原位修復提供了一種更合適的和更有前景的工具細胞。使用CRISPR/Cas9n技術刪除臨床級hESC細胞系中內源性SNCA基因,可以降低病患者腦內路易體的發生率[13],為治療帕金森氏病(PD)提供了一種新的細胞替代治療策略。事實上,相對于其他干細胞,由于胚胎干細胞的分離和純化較為繁瑣、定向分化的機制尚不明朗等風險因素較難在臨床中大規模應用,但是單倍體胚胎干細胞已經在基因組印記、遺傳篩選、基因突變細胞文庫構建等方面得到了廣泛的應用。

2 間充質干細胞的研究與應用

2.1 間充質干細胞的建系

間充質干細胞,又稱多潛能基質細胞,是源于中胚層和外胚層的多能干細胞,可以從結締組織或器官間質分離獲得,研究顯示,使用基質膠消化法得到的ADMSCs成脂、成骨分化潛力優于直接消化法。DMEM/F12培養基、MEM培養基等是MSCs體外培養的常用培養基,培養體系中最適宜的鋅離子濃度為10-7mol/L,過高過低均損害骨髓間充質干細胞的增殖能力。程明等[14]利用質粒和脂質體共轉染,得到穩定表達TERT基因的嶗山奶山羊BMSCs。目前,研究人員相繼建立了兔子、豬、鼠、牛、人等物種的間充質干細胞系,為相關物種的繁育、種質基因庫研究奠定了基礎。

2.2 間充質干細胞的誘導分化

相對于其他成體干細胞,MSCs具有強大的增殖能力和多分化潛能,目前,MSCs可被誘導分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌細胞、神經細胞、肝細胞、內皮細胞、基質細胞等多種細胞,同時,國際細胞治療協會(ISCT)確定體外可誘導為脂肪細胞、成骨細胞、成軟骨細胞的能力為MSCs鑒定的必檢指標。MSCs的分化能力和分化方向受到信號通路、培養體系、關聯基因等因素的調節。徐弘遠等[15]提出微環境可通過改變細胞骨架形狀、架構等因素影響間充質干細胞分化趨向。賀繼剛等[16]研究發現:miRNA-673-5p通過抑制TSC-1蛋白的表達進而促進BMSCs向心肌樣細胞分化,BMSCs的成骨分化受到多基因的調節,如RAI3基因敲除可促進BMSCs的體外和體內成骨[17],過量表達Lgr5的BMSC表現出更強的成骨能力,抑制Lgr5表達會降低BM-MSC的成骨分化能力[18]。這為BMSC在骨再生中的應用開辟了廣泛的研究模型。

2.3 間充質干細胞的應用

MSCs因其突出的抗氧化活性、免疫重構等特性,是臨床研究和應用最為深入的干細胞。其中,美國批準了60余項間充質干細胞的臨床試驗,已成為阿爾茨海默病、漸凍癥等疾病的新興治療方案。腦室內注射的BMSCs可以通過改善星形細胞炎癥和誘導突觸發生,修復AD模型小鼠的認知障礙[19],BMSCs移植可以通過抑制T細胞的增殖和活化,減少炎癥細胞因子的產生,阻止實驗性自身免疫性腦脊髓炎的發展;通過增強胞葬作用,促進心肌I/R大鼠心肌炎癥的消退[20]。劉廣洋等[21]研究發現MSCs可以通過抑制肺部浸潤的免疫細胞減輕急慢性肺損傷。脂肪間充質干細胞(AMSCs)因其來源方便的特點,被廣泛應用于急性心肌梗死治療、急性肝臟衰竭、腦損傷記憶障礙、造血調控等方面的探討研究。AMSCs鞘內移植可以改善脊髓栓系綜合征大鼠后肢運動能力,有效促進其損傷神經的修復[22],AMSCs大鼠左側海馬CA3區移植可以增強癲癇大鼠血清及海馬組織中的自由基清除能力,有效改善機體的氧化應激效應。外泌體是間充質干細胞旁分泌的重要組成部分,源于hMSCs的外泌體能夠抑制成纖維細胞樣滑膜細胞系的增殖和遷移,促進其凋亡,為類風濕關節炎的治療提供新的治療策略[23]。富含miR-17-92簇的mMSCs外泌體可以被大鼠周圍神經末梢攝取,并逆行運輸到前角的DRG神經元和脊髓運動神經元,大大增加了中風大鼠神經可塑性、神經發生和功能恢復[24]。小鼠腦損注射hADSC-ex后,優先被小膠質細胞/巨噬細胞攝取,并通過NF-κB和p38-MAPK信號通路減輕神經炎癥反應,從而改善大鼠創傷性腦損傷微環境,促進感覺運動神經的再生和功能的恢復[25]。外泌體為間充質干細胞在組織損傷修復、抗炎治療、神經系統疾病、藥物運載體研發等領域的應用提供了新的視角。

3 誘導多能干細胞的研究與應用

3.1 誘導多能干細胞的建系

誘導多能干細胞是通過導入特定的轉錄因子將終末分化的體細胞重新編程逆轉為多能性干細胞。2006年日本京都大學Shinya Yamanaka利用病毒載體將轉錄因子Oct4, c-Myc, Kif4, Sox2導入小鼠成纖維細胞,獲得首例iPSCs,目前,約有10個基因可以參與體細胞向iPSCs的誘導轉化。iPSC性狀與ESC相似,具有相同的二倍體核型、高度的自我更新能力。但是,iPSC建系完成后往往需要從細胞和組織功能水平等方面進行鑒定排查,如胚胎干細胞標志物是否表達、啟動子去甲基化程度、是否致畸胎瘤等。目前,國內外構建的人iPSC系多來源于羊水細胞、尿細胞、外周血單核細胞、腎上皮細胞、成纖維細胞等。其中,尿源性細胞因為更容易獲取、成本低廉、無創傷,重編程效率高,同時不受性別、年齡和身體狀況等實驗因素干擾的優勢而廣受關注。

3.2 誘導多能干細胞的分化

目前,iPSC細胞可被誘導分化為生殖細胞、心肌細胞、神經細胞、上皮細胞、破骨細胞、胰島分泌細胞等終末分化細胞,甚至間充質多能性干細胞。Kitajima等[26]將黑猩猩成年皮膚成纖維細胞誘導為iPSCs,并重建了早期神經發育過程,為更好地理解黑猩猩及人腦神經發育的分子細胞學基礎提供了有力的工具[27]。UQCRC1 p.Y314S突變的外周血單個核細胞可以誘導建立iPSCs系,并在體內向3個胚層分化[27];利用癲癇患者外周單核細胞,誘導產生了攜帶PIK3R2雜合突變的人iPSC細胞系,不僅能夠分化為3個胚層,并表達內源性多能性標記物,使得更好地理解癲癇及其早期用藥篩選成為可能[28]。營養物質不僅影響體細胞向iPSC細胞系的重編程過程,同時可以決定iPSC特定細胞系的分化形成[29]。Hepburn等[30]借助誘導性泌尿生殖竇間充質共培養技術,大大提高了iPSC體內外分化為前列腺組織的成功率。高通量測序結果顯示,通過調節與TGF-β信號通路microRNAs 的表達可以促進hiPSCs向NSCs的誘導分化[31]。

3.3 誘導多能干細胞的應用

事實上,iPSC細胞系因其無倫理障礙、來源容易、免疫排斥小、強分化能力等獨特優勢,開啟了細胞治療、發育分化研究、疾病模型建立及藥物評價的新紀元。自體皮膚成纖維細胞來源的iPSCs移植可發揮免疫調節作用,如有效緩解大鼠的急性肺損傷和減少炎癥因子釋放,改善小鼠腎組織損傷并對系統性紅斑狼瘡具有一定的治療作用。iPSCs技術的成熟極大地推動了神經組織損傷修復和再生醫學的研究進程,研究人員首次成功地將人血細胞直接重新編程成為神經板邊界干細胞,這些iPSCs可以產生神經嵴和中樞神經系統譜系的功能細胞類型,并可以通過基因編輯技術建模人類疼痛綜合征[32]。吳軒[33]完成了iPSCs定向分化為運動神經元及3D神經網絡的構建,為神經疾病模型構建和治療研究提供了優秀的細胞模型。此外,小鼠右側腦室內注射的iPSCs通過歸巢效應,可顯著減少缺氧缺血性腦病新生小鼠神經元的丟失和修復腦損傷。研究顯示,hiPSCs可以被定向誘導為人視網膜色素上皮細胞和光感受器,穩定或者恢復動物模型視力。此外,利用帶有疾病基因的體細胞重編程的iPSCs,為發病機制、藥物開發以及治療方案的研究提供了更加真實的開發平臺,利用CRISPR-Cas9系統建立的Peptide transporter-ko iPSCs被用于腸道藥物吸收效力的研究[34],多重耐藥基因1-ko iPSCs為MDR1潛在底物評估與藥代動力學測試提供了良好的研究模型[35],但是,真正應用于人類治療的iPSCs細胞來源方案和移植程序等仍然需要優化和驗證。

MSCs,iPSCs和EMCs在組織損傷修復、疾病模型建立、藥物評價等應用領域均具有各自明顯的優勢,同時也面臨著諸多挑戰和應用短板。在安全性方面,ESCs和MSCs的致瘤系數遠大于iPSCs,ESCs的倫理道德受限、維持未分化狀態時間短、遺傳不穩定、誘導分化效率低等狀況大大限制了其在臨床上的深入應用。iPSCs技術的重要性在于其打破了干細胞研究中不可回避的倫理道德和免疫排斥等局限,為干細胞的臨床應用和研究提供了一個全新的視角,但值得注意的是,截至目前,不同組織、器官來源或不同發育階段的體細胞生成iPSCs的效率和安全性仍存在較大差別。因此,干細胞研究領域未來在某些領域仍需要突破性成果來促進其應用價值的發揮,例如: 1)闡明其增殖、分化的內部機制,以促進神經科學、心臟病學和再生醫學中的疾病模型的建立與應用;2)基因組編輯工具在干細胞領域的成熟運用,以提高干細胞應用的安全性和穩定性;3)廣泛利用組織工程學、3D支架技術對培養體系進行改造,提高干細胞應用的可重復性和標準化等。