根瘤菌多樣性研究技術進展

馬蓮菊, 朱 淼, 汪雅楠, 朱夢卓, 趙曉妍, 董芮萌, 王 澤

(沈陽師范大學 生命科學學院, 沈陽 110034)

0 引 言

根瘤菌屬于革蘭氏陰性菌,呈桿狀或球狀,與特定宿主植物結瘤形成共生固氮體系[1]。共生固氮體系的形成由多方面因素共同調節,植物在根瘤菌刺激下產生類黃酮物質激活結瘤基因nod,根瘤菌內部會產生根瘤菌粘附素(rhicadhesin)以及胞外多糖等物質,在這一系列物質共同作用下使其附著于根部[2]。根瘤菌借助于植物的根毛尖端位置進入宿主植物的皮層,在皮層處進行大量繁殖。皮層細胞則由于根瘤菌的分泌物刺激而快速分裂,最后根瘤菌被包裹于該皮層細胞中央,二者結合形成根瘤。豆科植物為根瘤菌提供水、有機物和礦物質等,根瘤菌則幫助豆科植物將空氣中游離的氮還原為銨態氮,為植物提供氮源,同時使土壤肥力得到提升[3]。

根瘤菌在農業、環境和生態等方面起著可持續發展的作用[4]。根瘤菌多樣性是指不同根瘤菌在生理結構、生化特征和基因結構等方面表現的特異性差異。根瘤菌在長期進化過程中不僅受宿主的選擇,而且也受環境因素影響,因而根瘤菌不斷地朝著多個方向演變和進化,致使其生物多樣性豐富[5]。目前,在生物固氮研究領域內,根瘤菌多樣性研究是一個熱點,研究技術體現出多學科的交叉、滲透與綜合[6]。系統發育是現代根瘤菌分類系統得以建立的一個重要基礎,通過對根瘤菌系統發育開展進一步的分析,能夠把握根瘤菌與其他相關菌種之間的聯系,同時也能分析根瘤菌演變的歷程,進而可以確定根瘤菌在系統中的地位。本文對根瘤菌表型多樣性和遺傳型多樣性的研究技術進行綜述,以期為根瘤菌的系統分類提供理論依據。

1 表型多樣性

根瘤菌的表型分群是指在根瘤菌的形態特征、血清學反應及其生理功能等方面,利用數值分類[7]、全細胞可溶性蛋白電泳[8]、多位點酶電泳[9]和細胞脂肪酸組成分析[10]等技術進行初步分群,揭示根瘤菌的生物多樣性。

1.1 數值分類

數值分類法是細菌分類中常用的一種方法,主要是借助計算機系統對所需要分類的細菌或根瘤菌表型性狀的相似程度進行數值分析歸類。數值分類結果與傳統方法分類結果一致,但與傳統方法相比具有一定優點。通過借助計算機對表型特征數據進行比較,計算機的分析可以在一定程度上有效避免人為主觀性對結果造成的影響[11]。另外,實驗過程經過對表型系統分析可得到聚類分析圖譜,能夠準確揭示表型一致或差異的根瘤菌菌株,此過程以相似性80%作為種群劃分標準[12]。

數值分類通常被用在根瘤菌多樣性和分類的初步研究中,谷峻等[13]通過采用表型數值分類等方法,對20株甘草根瘤菌在碳、氮源以及生理生化性狀等方面進行測定分析,結果表明,與甘草共生的根瘤菌分為3個菌屬,具有豐富表型多樣性。劉洋等[14]主要對30株巖黃芪根瘤菌不同方面進行研究,從營養利用、抗生素抗性到抗逆性等方面分析結果進行數值分類,得出不同地域或不同宿主的根瘤菌都具有豐富表型多樣性的結論。韋革宏等[15]也通過采用數值分類的方法,在唯一碳、氮源的利用等方面對40株菌株進行測定,同樣證實了供試菌株具有表型多樣性。

1.2 全細胞可溶性蛋白電泳

全細胞可溶性蛋白電泳,即SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,是應用于細胞表型多樣性研究的重要基礎。該電泳技術既能夠準確地分析各種可溶性蛋白的組成成分,又能夠對生物蛋白質圖譜的信息進行分析和研究。根瘤菌的蛋白質結構復雜,多態性信息量大,利用全細胞可溶性蛋白電泳技術研究根瘤菌,從蛋白質電泳圖譜上表現出來的多態性能夠反映出根瘤菌的多樣性[16]。隨著技術的發展,凝膠掃描以及分析軟件的出現與普及,SDS-PAGE在原本基礎上變得更加快速、簡便且重復性好。近年來,SDS-PAGE技術被用于菌種相互之間與種內差異的分析與研究[17]。汪恩濤等[18]運用凝膠電泳技術,對40余種根瘤菌菌株的可溶性蛋白進行分析測定,結果證明此方法可用來分析根瘤菌表型多樣性。閆愛民等[19]對干旱地區根瘤菌菌株進行電泳分析,結果證明蛋白分析的聚類結果與數值分類結果相近。劉曉云等[20]也采用了SDS-PAGE分子標記法,對篩選的120株根瘤菌進行初步分群得到 104個類型。

1.3 多位點酶電泳

多位點酶主要是指不同位點上的基因序列所編碼的具有相同作用的酶。通過多位點酶電泳技術(MLEE)對根瘤菌多樣性進行分析是利用酶的特異性的原理對酶進行分離,即不同種類的酶與特異性底物反映顯示不同顏色,最后對電泳的遷移率進行比較,得到酶譜推理根瘤菌多樣性[21]。利用多位點酶電泳技術分析菌落多樣性在根瘤菌表型多樣性分析中具有重要地位。在根瘤菌分類與表型多樣性研究中,多位點酶電泳技術已被證明是初步分群的有效辦法。王素英等[22]對黃芪根瘤菌,許曉東等[23]對天山根瘤菌利用多位點酶電泳技術進行研究分析,結果表明,多位點酶電泳圖譜聚類分析結果與數值分類的結果基本一致,可以作為根瘤菌分群手段。李穎[24]對寧夏沙坡頭地區的17種根瘤菌進行多位點酶電泳分析,結果表明異檸檬酸脫氫酶、超氧化物歧化酶等酶譜更有利于區分不同根瘤菌種群。

1.4 細胞脂肪酸組成與脂多糖分析

脂肪酸是酯類和其他脂多糖的重要構成部分,在細胞膜上廣泛存在。不同種屬細菌對應的脂肪酸碳鏈的取代基團、雙鍵位置和長度等方面存在較大差異。微生物學研究表明,細菌的DNA與細胞結構中常見的脂肪酸具有高度的同源性,不同類型的細菌含有的脂肪酸在含量或組成成分上存在差異,且差異具有穩定性。因此,建立具有不同種類細菌獨特特征的細胞脂肪酸指紋圖譜,可得到目的菌株的表型多樣性[25]。根瘤菌的脂多糖結構和根瘤菌豆科植物共生固氮體的形成有著密切關系。與細胞脂肪酸同理,對于不同種類根瘤菌,通過脂多糖分析可將糖的排列方式與種類的差異反映出來[26]。

目前,脂肪酸分析各部分技術均可高度自動化。張小平等[27]對分離自花生的22種根瘤菌的細胞脂肪酸組成進行測定,結果顯示花生根瘤菌的進化方向與大豆根瘤菌一致,說明細胞脂肪酸組成分析法結果具有可信性。程濤等[28]采用全細胞脂肪酸組分分析法,對分離自木本豆科植物的根瘤菌進行鑒定,結果發現所測的2株根瘤菌為根瘤菌屬中的新種。卜常松等[29]通過氣相色譜分析大豆根瘤菌的細胞脂肪酸,最終將供試菌株分為6種不同菌株。

2 遺傳型多樣性

表型特征能夠綜合反映出根瘤菌表型多樣性,但無法將根瘤菌的全部遺傳信息反映出來。有研究表明,在表型多樣性分析中即使將待測菌株的指標增加至300項,經過聚類分析得到的結果也只能反映該生物的5%～20%的遺傳信息[30]。遺傳信息主要儲存在核酸內,通過對核酸信息變化進行分析,可以揭示根瘤菌間親緣關系。因此,選擇基因序列或一些特定基因片段進行檢測已成為建立根瘤菌系統發育系統的常規手段[31]。

2.1 基因組水平指紋圖譜

基因組水平指紋圖譜分析是指在基因組水平上檢測并分析基因的多態性。不同的生物個體或不同種群在基因上存在差異,利用基因組水平指紋圖譜分析可以對其進行分類。基因組水平研究的主要手段有基因組物理結構分析、隨機擴增DNA片段的多態性分析、AFLP指紋分析技術、rep-PCR指紋分析技術和穩定小分子RNA圖譜等。

1) 基因組物理結構分析是通過對細菌全基因組DNA序列進行分析,得到目的菌株全部遺傳信息,是目前研究系統發育最為準確的方法,但對于大量待測菌株而言,耗資巨大。鄭君芳等[32]利用Ⅰ-CeuⅠDNA內切酶對64株根瘤菌總DNA進行酶切,通過基因組物理結構分析明確了根瘤菌系統的發育關系。

2) 隨機擴增多態性DNA標記技術(RAPD) 是通過對PCR產物開展分析,同時借助生物性狀表現規律和基因排列間的相互關聯完成一系列預測。該項技術需要選用寡核酸片段來作為引物,一般為8～10 bp核苷酸片段,利用PAGE電泳技術開展DNA多樣性的檢測[33]。陳麗云等[34]通過RAPD技術對分離自苜蓿和草木樨的根瘤菌進行分析,結果表明17株菌株分別來自6個不同菌系。隋新華等[35]利用RAPD等方法對分離自我國北方山黎豆屬和棘豆屬的植物根瘤菌進行研究,結果表明山黎豆屬植物主要與根瘤菌屬結瘤,而棘豆屬植物主要與中華根瘤菌屬結瘤。楊成運等[36]通過RAPD等方法對分離自我國亞熱帶地區42株豌豆根瘤菌進行研究,結果表明這些供試菌株具有明顯的地域特征。

3) AFLP指紋分析技術[37],即對擴增片段長度多態性進行分析。隨著儀器設備的更新,AFLP技術結合熒光標記技術稱為FAFLP技術。FAFLP技術使多態性分析技術反應可在測序儀器上進行,數據更加標準,也使AFLP指紋圖譜相互比較更加方便[38]。建立AFLP指紋圖譜信息數據庫,便于AFLP比較,增加信息穩定性和可靠性[39]。陳強等[40]運用AFLP等技術對四川省23株葛藤屬根瘤菌進行遺傳特性研究,經過分析顯示,此批菌株分為7個遺傳群。賈騰飛等[41]在已建立的AFLP體系下,結合地理生物學因素,對青海省不同地區的蠶豆根瘤菌進行遺傳特性研究,結果可將這些根瘤菌分為2個AFLP遺傳群,2個主群又分為4個亞群。徐開未等[42]應用RFLP,AFLP等技術對涼山州新銀合歡中分離的33株根瘤菌進行遺傳特性研究,結果表明,這些根瘤菌有豐富的多樣性,可分為4個菌屬。

4) rep-PCR指紋分析技術是指對根瘤菌基因組重復序列進行PCR的技術。根瘤菌基因組中分布較為廣泛的短基因序列有REP[43], ERIC[44]和BOX[45],這些短基因序列都存在于根瘤菌基因組中,堿基小于200 bp且含有多個拷貝。Mosbah等[46]運用rep-PCR技術對沙特阿拉伯西南部5種植物中分離得到的75株根瘤菌進行遺傳多樣性鑒定,結果表明可將其分為4個已知的結核桿菌屬,具有良好多樣性。孟頌東等[47]和李俊等[48]應用rep-PCR技術對新疆大豆根瘤菌和中國花生根瘤菌進行指紋分析,結果表明來自同一地區根瘤菌具有較高遺傳相似性,不同地區根瘤菌間有豐富的遺傳多樣性。

5) 穩定小分子(LWMRNAS)RNA圖譜包括5S rRNA和tRNA,該技術在微生物分類鑒定方面具有很大的潛力[49]。穩定小分子RNA有穩定且能反映種屬差異的特點,常被應用于根瘤菌的分類研究中[49]。楊帆等[51]對穩定小分子量RNA指紋圖譜技術的原理和發展歷程進行綜述,同時對該技術在根瘤菌分類研究中的應用現狀和前景進行了闡述。

2.2 特殊基因擴增片段酶切圖譜分析

根瘤菌屬于原核生物,rRNA包括5S, 16S和23S 3種。5S rRNA片段小,能夠攜帶的遺傳信息少,不能體現微生物多樣性;16S rRNA, 23S rRNA, 16S-23S rRNA基因間隔區序列(IGS)等序列攜帶遺傳信息可以體現遺傳多樣性,因此可選擇16S rRNA, 23S rRNA, IGS序列的特異性片段、限制性片段進行研究[52]。特異性片段多態性分析(ARDRA)技術常被用于根瘤菌種、屬水平的分群和系統分類研究中[53]。李彪等[54]對在蘭坪鉛鋅尾礦區豆科植物分離的49株根瘤菌進行ARDRA分析,結果表明這些根瘤菌在系統發育樹中分別屬于3個系統發育分支,進一步說明其具有良好的遺傳多樣性。

16S rRNA序列是最早被用于根瘤菌分類揭示根瘤菌系統發育的保守基因[55],16S rRNA全序列的測定在細菌分類中占有不可或缺的地位[56]。研究發現種間有16S rRNA基因片段相互轉移的現象,即16S rRNA核苷酸序列中包含了不同來源的16S rRNA序列[57-58],這些研究結果表明如果僅依據根瘤菌的16S rRNA建立系統發育體系,確定菌株多樣性較為片面,確定菌株種屬應建立在多個基因序列分析乃至全基因組序列分析的基礎上。

隨著基因組測序技術的發展與完善,有專家學者在研究根瘤菌系統發育時會選擇23S rRNA基因序列分析。Van等[59]通過對rrn操縱子內3個位點的測序分析,比較一組具有代表性的α-變形桿菌之間的進化關系,得出23S rRNA與16S rRNA序列分析的結果有很大差異性。23S rRNA核苷酸序列有種間或菌株間特異性和高度變異區,針對這一特性可以利用原位雜交探針鑒定根瘤菌遺傳型多樣性,該技術在根瘤菌遺傳多樣性研究中具有重要地位。潘峰等[60]采用16S-23S rRNA基因區間(intergenic spacer region, ISP)的PCR-RFLP對飯豆根瘤菌進行了遺傳型多樣性和系統發育分析,發現所有菌株最終形成了慢生型菌群與快生型菌群兩大菌群。高俊蓮等[61]選取40株未知斜莖黃芪根瘤菌與14株已知根瘤菌,通過23S rRNA PCR-RFLP比較分析,結果發現其具有良好的遺傳多樣性且與聚類分析樹狀圖譜有較好的一致性。

3 展 望

根瘤菌作為一種高效的自然微生物資源,其開發利用越來越引起人們的關注。近年來,根瘤菌多樣性研究技術取得了長足的發展,從早期利用數值分類和SDS-PAGE等方式研究表型多樣性,到目前利用根瘤菌基因序列研究遺傳多樣性,這樣既有助于人們對根瘤菌多樣性以及系統發育的深入研究,也提高了研究結果的準確性。在系統發育研究中,多技術的綜合應用可提高實驗數據的準確性,對根瘤菌系統發育研究有著重要意義。

豆科植物除了有共生固氮改善土壤養分的作用,還可以起到保護水土、防風固沙和改善土壤環境等重要作用,而這些作用都離不開根瘤菌。我國豆科植物資源非常豐富,遍布于溫帶、亞熱帶等多個地區,根瘤菌來源豐富。大力開發不同環境條件下、不同宿主植物中根瘤菌,以及分離篩選出人們能夠加以利用的優勢菌種具有重要意義。目前,根瘤菌資源的開發利用率還較低,只有較少一部分的根瘤菌被制作菌劑,用于農業生產、環境改善和科學研究等方面。因此,現階段主要任務除了對已開發的菌種資源進行有效的保護和深入研究外,還應繼續對自然界中新分離篩選的根瘤菌進行種屬分類,進一步豐富擴大根瘤菌菌種資源庫。