非編碼RNA在生防菌-植物線蟲-寄主互作中的研究進展

陳立杰 楊帆 范海燕 趙迪 王媛媛 朱曉峰 劉曉宇 段玉璽

（1. 沈陽農業大學植物保護學院 設施園藝教育部重點實驗室（沈陽農業大學），沈陽 110866；2. 沈陽農業大學分析測試中心， 沈陽 110866；3. 沈陽農業大學生物技術學院，沈陽 110866；4. 沈陽農業大學理學院，沈陽 110866）

非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）是指不編碼蛋白質的RNA，包括rRNA，tRNA，snRNA和microRNA 等多種已知功能的 RNA，還包括未知功能的circRNA和lncRNA等。這些RNA的共同特點是都能從基因組上轉錄而來，但是不翻譯成蛋白，在RNA 水平上就能行使各自的生物學功能。其中microRNA（miRNA）、circRNA和lncRNA是目前生物學領域主要的研究熱點。

植物線蟲可危害多種蔬菜作物，是世界上最難防治的土傳病原物，線蟲通過其分泌物誘導和調節寄主植物的細胞發育為自己建立專門的巨細胞，從而為其不斷地供應營養，建立穩定的互作關系。生防菌指那些可以防治植物病害的各種微生物，包括細菌、真菌和放線菌等。生防菌可有效控制線蟲危害，并激發植物對線蟲的免疫機制，一直是研究的熱點。而生防假單胞菌（Pseudomonas）是防治作物根結線蟲病的重要生防菌，如熒光假單胞菌（P. fluorescens）［1-2］和惡臭假單胞（P. putidaSneb821），具有毒殺線蟲、誘導番茄抗性和促生長等多方面作 用［3］。Yang等［4］研 究 發 現ncRNAs中miRNA、lncRNA和circRNA等響應惡臭假單胞Sneb821激發番茄免疫抗南方根結線蟲的侵染，預測到lncRNA44664關 聯 到miR396/GRFs，lncRNA48734關聯到miR156/SPL，這些發現為生防細菌誘導番茄抗根結線蟲侵染的機理提供了新的分子調控模型。為探究ncRNAs在植物與線蟲互作過程中的作用以及植物、病原物和生防菌三者之間的關系，本文闡述了植物線蟲、生防假單胞菌與寄主互作中ncRNA的研究進展，剖析植物線蟲病害研究中ncRNAs發揮何種作用，旨為植物線蟲學理論研究新領域添磚加瓦。

1 miRNA 響應植物線蟲脅迫和假單胞菌誘抗的研究進展

1.1 miRNA響應植物線蟲脅迫的研究進展

ncRNAs中只有miRNA在植物線蟲領域研究較多，也是最早被鑒定到參與免疫反應的小RNA分子。miRNA的主要功能是通過引起靶基因mRNA的降解或者阻止靶基因mRNA的翻譯，進而抑制靶基因 功能［5］。

植物寄生線蟲如胞囊線蟲和根結線蟲會在寄主根系形成特殊的取食細胞如合胞體和巨細胞，是寄主細胞的基因被額外誘導表達形成的新型取食細胞，其中miRNA發揮了作用［6］。miR396在擬南芥和大豆中靶向生長調控因子GRF，在植物線蟲侵染寄主形成取食細胞時通過調節GRF1、GRF3［7］和GRF6、GRF9［8］等基因表達而影響取食細胞的發育，證實miR396/GRF分子模型調控取食細胞形成的作用具有保守性。Cabrera 等［9］證明miR390a和TAS3在根結和巨細胞中可共表達，根結形成過程需要 miR390/TAS3/ARF3 分子模型調控。Zhao 等［10］發現番茄的 miR319/TCP4 和miR396/GRF 潛在的交互作用可能介導了對根結線蟲的抗性。Díaz-Manzano等［11］研究發現miRNA172/TOE1/FT基因調控模型在爪哇根結線蟲侵染擬南芥的巨細胞形成和發育過程中通過修飾生長素而起到重要作用。

擬南芥接種胞囊線蟲后，miRNA及其靶基因呈負調節關系，其中miR156、miR159、miR172和miR396 表達量下調［6］。miR159不但自身可以受到生長素誘導，它還可以調控 MYB33和 MYB65的表達［12］，并參與調控抑制了寄主根結中靶基因MYB33的表達從而限制南方根結線蟲的早期侵染［13］。Pan等［14］分析miR159-MYB，miR319-TCP4 和 miR167-ARF8 三對基因調控模型的逆表達方式可能響應了南方根結線蟲侵染棉花根系的脅迫反應。

1.2 miRNA響應假單胞菌誘抗的研究進展

擬南芥 miR393 是第一個在植物免疫應答過程中起關鍵作用的 ncRNA，被丁香假單胞菌鞭毛蛋白 flg22 誘導激發，miR393、miR160 和 miR167 通過抑制生長素信號途徑而影響細菌的侵染［15］。Flg22 是被用于 PTI（PAMP-triggered immunity，PAMP 觸發免疫）體系中重要的元素可誘導胼胝質沉積，但是人們對 PTI 在根系上的作用，尤其是在植物與線蟲互作中作用知之甚少。Lee 等［16］證明了來源于丁香假單胞菌的 RNA 激發了擬南芥的先天免疫反應。細菌侵染擬南芥后 miR398a 和 miR773 表達量降低，調控靶基因 SOD 上調表達來抵抗細菌侵染。miR858-MYB83調控系統被證明具有平衡甜菜胞囊線蟲對擬南芥致病性的優異分子功能［17］。我們的研究也發現lncRNA48734-miR156-SPL和lncRNA44664-miR396-GRF也參與了生防假單胞菌Sneb821調控的番茄抗南方根結線蟲侵染的生物學過程［4］。

?wi?cicka等［18］研究證實miRNA與NBS-LRR和激酶接受子家族RLKs成負相關性，顯示miRNA介導的R基因抑制可能是馬鈴薯金線蟲致病番茄的關鍵調控因子。NBS-LRR（nucleotide binding siteleucine rich repeat，甘氨酸結合位點和亮氨酸富集重復）結構是迄今從植物中克隆到的最大一類抗病基因，NBS-LRR介導了植物對專性和半專性寄生病原物的抗性［19］。番茄基因組中NBS-LRR基因家族中CNL（CC-NBS-LRR）亞家族成員擴展程度大于TNL（TIR-NBS-LRR）亞家族，已克隆的番茄抗爪哇根結線蟲Mi-1、Mi-9和抗馬鈴薯白線蟲Gpa2基因都屬于CNL亞家族，而番茄中抗馬鈴薯金線蟲Hero抗病基因和小麥中抗燕麥胞囊線蟲的抗病基因Cre3和Cre1屬于NL（NBS-LRR）亞家族［20-21］。陸秀紅等［22］初步從番茄中獲得2條具有NBS-LRR保守結構域的序列，F5-8與Mi-1相應區域氨基酸相似，F5-20與Hero基因相似。番茄通過lncRNA23468-miR482b-NBS-LRR調控模式抵抗致病疫霉的侵染［23］。生防芽胞桿菌AR156誘導了擬南芥抗PstDC3000的侵染，是miR825和miR472受到抑制從而增強NBSLRR基因家族CNLs介導基礎免疫而實現的［24-25］。有人提出了NBS-LRRs和miRNAs的共進化模型假設，是植物平衡NBS-LRR 抗病基因的收益與成本的結果［26］。

2 lncRNA和circRNA 對植物病原物脅迫的響應

2.1 lncRNA對植物病原物脅迫的響應

lncRNA是一類長度大于 200 個核苷酸的非編碼 RNA。Zhang等［27］研究了棉花響應病原真菌大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）的lncRNA表達譜，功能分析顯示兩個core lncRNAGhlncNAT-ANX2與GhlncNAT-RLP7沉默的幼苗對病原真菌的抗性增強，可能與LOX1和LOX2的表達增加有關。我們前期的研究表明，lncRNA48734和lncRNA44664可能參與到番茄的免疫激活過程當中［4］。Qin等［28］鑒定到一個lncRNA（DRIR）在干旱和鹽脅迫下起到正調節作用，過表達DRIR基因的擬南芥突變體具有抗旱耐鹽的能力。lncRNA-At5NC056820 過表達轉入擬南芥中，轉基因植株能夠在一定程度上提高擬南芥的耐旱性［29］。番茄的lncRNA23468-miR482b-NBSLRR調 控 模 式［23］和WRKY1-lncRNA33732-RBOH模型調控H2O2積累［30］，也是通過ncRNAs調控番茄生物學過程從而達到抗病的作用。

2.2 circRNA對植物病原物脅迫的響應

circRNA（環狀RNA）是一類由前體mRNA選擇性剪切產生，3'和5'末端共價結合形成環狀單鏈閉合的ncRNA，最早于20世紀70年代在馬鈴薯紡錘塊莖類病毒病樣中被首次發現［31］，但由于大多低豐度表達、閉環結構等特點而不被認識。2013年Memczak等［32］利用高通量測序技術分別在人、小鼠和線蟲中確定了成百上千個circRNAs的存在，而后研究者在各類生物中陸續挖掘到circRNA并鑒定其功能，使其成為RNA研究領域的又一個新征程［32-34］。circRNA 作為 miRNA 的“海綿”及競爭性內源 RNA 結合胞內 miRNA，阻斷miRNA 對其靶點 mRNA 的抑制作用，從而調節基因表達［35］；或與調控元件結合、或與蛋白互作調控基因的轉錄［36］；也可影響親本基因的選擇性剪切和表達水平［37］；并參與多種生物學過程，在植物生長發育和脅迫應答過程中發揮特殊作用［33，38-40］。

自 2014 年在模式植物擬南芥中首次發現植物 circRNA 以來，在水稻和番茄等十余種植物上有所研究，近3年人們開始關注生物脅迫下 circRNA 作用。如研究發現 circR5g05160 激發了水稻免疫抗稻瘟病菌侵染［41］。有 3個 circRNA 基因與甜瓜蔓枯病抗性相關［42］。馬鈴薯中發現了circRNA可能通過作為 miRNA “海綿”來調節對馬鈴薯軟腐病菌的免疫應答［43］。lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA 調控網絡在西瓜響應 CGMMV（黃瓜綠斑駁病毒）侵染中發揮重要作用［44］。

3 總結與展望

植物受病原物脅迫時，lncRNA和circRNA多通過 miRNA 調控 mRNA 起作用，但目前所鑒定的 circRNA 數據量遠遠不夠，而且生物學功能未知太多，因此需要大量研究深入挖掘和證明 circRNA 的生物學功能與作用。

人們利用擬南芥突變體驗證了干擾miRNA和siRNA途徑會增加寄主對根結線蟲和胞囊線蟲的抗性［13，45-46］。Huang等［47］在擬南芥中表達了南方根結線蟲（M.incognita）16D10基因的發夾結構RNA發現，轉基因植株的根結線蟲數量下降了63%-93%。Steeve等［48］利用大豆胞囊線蟲中的RNAi機制，以編碼線蟲中特異蛋白MSP的基因為靶基因，在轉基因大豆中表達相應的siRNA（small interfering RNA）使轉基因大豆根中胞囊線蟲數量減少了68%，此外，殘存線蟲后代的繁殖能力也大大減弱。

RNAi作為一種新工具用于植物線蟲病害的防控正在被研究，但是距離真正應用還有一段距離。miRNA 是根際中植物與微生物互作和微生物群落形成的關鍵媒介，通過共進化，植物與相關微生物構成的共生有機體建立了跨界雙向通信通道［49］。干擾 miRNA 合成或分解途徑會增加寄主對線蟲的抗性［13］。對于根結線蟲這種高等的植物專性寄生物，RNAi 干擾可能會起到類似農藥的防治作用，而來源于生防菌調控的寄主 RNA 或有益微生物本身的 RNA，將來是否能夠作為防控植物線蟲病害的因子？2021年2月，中國科學院微生物研究所郭惠珊課題組提出利用有益微生物表達小 RNA，靶向病原菌關鍵致病基因的植物保護新方法［50］，也為線蟲生防菌的利用拓展了新思路。此外，Panstruga［51］認為細菌的RNA也可以作為一種新型的MAMP激發植物免疫反應。也有研究表明，蠟質芽孢桿菌AR156 可以通過激活MAPK 通路誘導擬南芥產生系統抗病性，并且一些miRNA在其中起到一定作用［52］。因此，深入研究和理解ncRNAs 在植物線蟲與寄主互作中的調控作用將為利用ncRNAs防控線蟲病害提供新思路。

ncRNAs的研究剛剛興起，目前的研究結果多顯示其參與了各種脅迫條件下植物的免疫響應，尤其是在線蟲的生物脅迫和假單胞菌的免疫激活方面研究逐漸增多。因此，假單胞菌作為生防菌激發植物對根結線蟲的RNA免疫調控機制研究將會為復雜精致的免疫調控分子機理提供新線索。