墓頭回提取物對急性髓系白血病完全緩解期患者骨髓源性樹突狀細胞功能的影響

王玉虹 夏小軍 崔 杰 姜俊峰 段 赟

甘肅省腫瘤醫院血液腫瘤科，甘肅蘭州 730050

微小殘留病灶（minor residual disease，MRD）是導致白血病復發的根本原因，而免疫療法已成為清除白血病微小病變的主要手段之一。白血病（leukemia）在獲得完全緩解后進行免疫治療可提高療效[1]。樹突狀細胞（dendritic cell，DC）是功能最強的抗原提呈細胞，在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）的發生過程中，其可彌補AML 細胞的缺陷，產生抗AML特異性的細胞毒性T 淋巴細胞。一些中藥作為免疫調節劑，能夠促進DC 的成熟，提高其抗腫瘤活性[2]。中藥墓頭回（Mutouhui，MTH）具有清熱解毒、消癰散結之功效，可用于治療腸道腫瘤、白血病等[3-5]，但MTH免疫治療白血病的作用機制還不清楚。因此，本研究將MTH 提取物體外作用于AML患者來源的DC，探討MTH 對促DC 成熟及功能的機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016～2018年甘肅省腫瘤醫院血液腫瘤科的15例AML 完全緩解患者，其中男8例，女7例；中位年齡29（15，43）歲；3例M2a，2例M2b，3例M3，1例M4，5例M5，1例M6。研究對象均簽署知情同意書，研究程序報甘肅省腫瘤醫院醫學倫理委員會審查批準。

1.2 骨髓單個核細胞的分離

抽取AML 完全緩解患者的骨髓10～20 mL（40 U/mL肝素抗凝），使用Ficoll 淋巴細胞分離液（美國Sigma公司）梯度離心法分離骨髓單核細胞（bone marrow monocytes，BMC），收集BMC 于10 mL 離心管中，離心棄上清，加入含10%滅活胎牛血清（杭州四季青生物制品公司）的RPMI1640 完全培養基（美國Gibco 公司）重懸細胞，調整密度濃度為5×106/mL。

1.3 樹突細胞的培養與MTH 的成熟誘導

將BMC 加入培養瓶中，置于37℃、5%二氧化碳培養箱培養3 h，加入含1000 U/mL 集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF）和500 U/mL rh IL-4的RPMI1640 完全培養基繼續培養，隔日半量換液。其中1例AML 完全緩解患者BMC 在第6 天時收獲未成熟DC，以4×106/mL 密度接種48 孔板（1 mL/孔，共15 孔）。將未成熟DC分為對照組（control）、LPS 組（陽性對照，加入10 μg/mL LPS）、MTH（上海同田生物技術有限公司）多糖組、MTH 皂苷類組、MTH 萜類組，后三組又分0.001、0.010、0.100 μg/mL 亞組，對照組、LPS 組和各亞組分別設三個平行對照；繼續培養48 h，觀察并收獲DC；同時收集培養上清，待測。

1.4 DC 的形態及免疫表型檢測

瑞氏-吉姆薩染色DC，倒置顯微鏡觀察DC。將待測細胞調至1×106/mL，取細胞懸液100 μL/管，分別加入15 μL PE 標記鼠抗人單克隆抗體CD1a、CD86 及FITC 標記鼠抗人單克隆抗體HLA-DR、CD80、CD83（購自美國Caltag 公司），混勻后置避光室溫下孵育30 min，用PBS 緩沖液洗滌2次，1000 r/min，5 min 離心洗滌后，1%多聚甲醛固定，流式細胞儀（FACS，美國Becton Dicknson 公司）檢測，數據用Cell Quest 軟件分析。

1.5 檢測DC 的IL-12（p70）分泌

按IL-12（p70）ELISA檢測試劑盒（美國Biosource公司）說明書檢測DC 上清液中IL-12 的含量，顯色后即刻用酶標儀（Wellscan Mk3，美國Labsystems Dragon 公司）在450 nm 波長處檢測光密度，根據標準曲線確定IL-12 的含量。

1.6 統計學方法

采用SPSS 21.0 統計學軟件（美國IBM 公司）進行數據分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩組間比較采用t 檢驗，不符合正態分布者采用中位數和四分位數間距[M（P25，P75）]表示，或者經過變量轉換為正態分布后行統計學分析，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTH 對DC 形態的影響

將AML 完全緩解患者BMC 成功誘導為DC。分離的BMC 經培養3 h 后，呈貼壁生長。在培養誘導1 d后，細胞較前略微增大。培養4 d 后，細胞聚集成簇，并向周圍伸出細小的樹突樣偽足。培養第7 天時，多數BMC 細胞已成為DC（圖1，封四）。加入MTH 培養2 d后，誘導的DC 發育成熟，懸浮在培養液中，可見細胞體積明顯變大，細胞周圍有明顯的絲狀樹突樣偽足（圖1，封四）。

2.2 DC 細胞膜表面標志物的表達

LPS 組、MTH 多糖組和萜類組的表面標志陽性表達率均高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；MTH多糖組0.100 μg/mL 亞組各DC 表面標志物的陽性表達率與LPS 組比較，差異無統計學意義（P>0.05）；MTH萜類組各DC 表面標志物的陽性表達率低于LPS 組，差異有統計學意義（P<0.05）；MTH 皂苷類DC 表面標志物的陽性表達率與對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05），但低于LPS 組，差異有統計學意義（P<0.05）；MTH 多糖組0.010 μg/mL 亞組的CD80、CD83、CD1a低于LPS 組，且低于0.100 μg/mL 亞組，差異有統計學意義（P<0.05），MTH 多糖組0.001 μg/mL 亞組的CD80、CD83、CD86、CD1a 低于LPS 組，且低于0.100 μg/mL亞組，差異有統計學意義（P<0.05）；MTH 萜類組0.010 μg/mL亞組的CD86 低于0.100 μg/mL 亞組，0.001 μg/mL 亞組 的CD80、CD83、CD86、CD1a 低 于0.100 μ/mL 亞組，差異有統計學意義（P<0.05）（表1）。

2.3 MTH 促進DC 分泌IL-12

MTH 多糖、萜類組和LPS 組的促進DC 分泌IL-12水平高于對照組（P<0.05），其中MTH 多糖和萜類組0.100 μg/mL 劑量亞組的分泌IL-12 水平高于0.001和0.010 μg/mL 劑量亞組，差異有統計學意義 （P<0.05）；而皂苷組促進DC 分泌IL-12 不顯著，差異無統計學意義（P>0.05）（圖2）。

3 討論

墓頭回別名腳汗草、擺子草、虎牙草，為敗醬屬植物異葉敗醬或糙葉敗醬的根莖和根，性涼，味苦，微酸澀。《神農本草經》記載主治火熱、火瘡、熱毒、疥癬、瘙癢、癰疽、痔瘡、瘰疬[6]。MTH 墓頭回提取物主要有皂甙、多糖、萜類和揮發油等，其主要化學成分是環烯醚萜類、單環降倍半萜苷類、三萜皂苷類、單萜類龍腦苷、黃酮類等[7]。MTH 對移植性肝癌和艾氏癌具有抑制效應[8]，并對分化型甲狀腺癌外周血多態性上皮黏蛋白1 陽性表達細胞具有抑制作用[9]，能抑制U14 移植瘤瘤體血管形成[10]。在MTH 誘導臍血基質細胞形成及分泌GM-CSF 的研究表明，MTH 不僅是強抗癌物質，也是造血祖細胞促進劑[11]。

表1 各組DC 表面標志物的陽性表達率（%，±s）

與對照組比較，*P<0.05；與LPS 組比較，▲P<0.05；與0.100 μg/mL MTH 同組劑量亞組比較，△P<0.05

組別 HLA-DR CD80 CD83 CD86 CD1a對照組LPS MTH 多糖（μg/mL）0.100 0.010 0.001 MTH 萜類（μg/mL）0.100 0.010 0.001 MTH 皂苷（μg/mL）0.100 0.010 0.001 20.17±13.36 75.09±13.32*13.43±10.23 70.35±12.24*12.37±11.27 80.14±17.49*19.34±16.21 79.53±21.46*14.03±10.39 74.46±20.67*78.08±15.34*68.34±26.19*57.40±25.21*72.23±15.54*43.19±17.23*▲△35.27±15.67*▲△77.34±26.13*46.17±15.80*▲△33.42±17.08*▲△82.25±17.46*66.57±16.54*53.26±23.15*▲△73.13±16.27*44.51±16.34*▲△35.13±17.54*▲△48.54±17.57*▲40.31±16.22*▲33.40±13.27*▲41.13±17.21*▲33.45±14.27*▲24.44±12.43*▲△43.33±16.18*▲31.17±13.34*▲23.11±11.32*▲△50.15±21.43*▲38.67±14.37*▲△35.17±13.45*▲△45.25±15.12*▲30.51±13.35*▲27.14±10.28*▲△20.18±13.12▲19.35±14.54▲19.12±14.44▲15.45±12.46▲16.09±13.43▲14.09±11.13▲16.37±14.13▲12.77±11.26▲12.46±10.38▲21.34±12.31▲19.26±15.16▲18.42±13.44▲14.49±10.67▲15.21±12.03▲16.45±12.31▲

圖2 MTH 各組DC 分泌IL-12 的水平（MTH：μg/mL）

AML 屬于髓系造血干細胞惡性腫瘤，由于腫瘤生長T 細胞克隆對AML 不應答及T 細胞的殺傷活性低于AML 細胞增生，當AML 在誘導緩解后進行免疫治療可減少其復發[12]。已有研究報道，AML 細胞能分泌血管內皮生長因子，抑制DC 的成熟，從而抑制其抗腫瘤效應[13]。DC 作為抗原提呈細胞具有顯著抑制腫瘤的生長效應，因此如何激活腫瘤發生過程中DC的功能，是當前腫瘤免疫治療的研究熱點[14-16]。

本研究發現，MTH 多糖、萜類能明顯誘導DC 成熟，上調DC 細胞表面標志的表達，刺激DC 分泌高水平的IL-12[17]。IL-12 能增加IFN-γ 的生產和刺激NK細胞、T 細胞的活化，也能增強抗體依賴性細胞毒性對腫瘤細胞的作用[18-20]。DC 表面有Toll 樣受體、熱休克蛋白等受體；Dectin-1是DC 表面特異性受體，可識別具有β-1，3 與β-1，6 連接的葡聚糖，并與Toll樣受體有協同作用[21]。CD80、CD83、CD86 及CD1a 等是DC 細胞表面協同分子，能夠刺激CD4+T 淋巴細胞分化為Th1 細胞或Th2 細胞，并協同MHC-Ⅱ分子，發揮免疫調節的作用[22]。本研究顯示，MTH 能促進DC細胞表面標志物的CD80、CD83、CD86 及CD1a 表達陽性率上調，進一步活化T 細胞，并促進MHC-Ⅱ分子HLA-DR 的上調，促進抗原遞呈。

綜上所述，本研究發現MTH 多糖和萜類均可增強DC 的功能，增加IL-12 的產生，但本實驗研究僅是體外實驗，還需要進一步通過動物實驗和臨床試驗驗證MTH 的臨床應用價值。