超聲-微波協同提取柚子皮多糖工藝優化及單糖組成、結構和抗氧化活性分析

江飛鳳，譚曉輝，胡鵬剛*，潘雪梅，閆錦

1(貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽， 550025)2(荔波昌輝食業有限公司，貴州 荔波， 558400)

柚子是蕓香科植物柚的成熟果實，產于廣東、福建、貴州等地區。柚子皮是柚子經人們食用或加工后剩下的表皮，約占整個柚子質量的30%以上。據研究報道柚子皮中含有多種生理活性成分[1]，如黃酮、多糖、香精油、類檸檬苦素、膳食纖維等[2]，提取的活性成分可用于制藥品及保健食品的開發[3-4]。據文獻報道，柚子皮中多糖含量較高[5]，許其亮[6]利用水提法提取柚子皮多糖，多糖得率為8.30%。然而，目前對柚子皮多糖的研究報道比較少，缺少對柚子皮多糖單糖組成、形態結構和抗氧化活性等方面研究分析。

多糖是指10個或10個以上單糖通過糖苷鍵縮聚而成的聚合物[7]，主要存在于動植物的體內和微生物的細胞壁中，分為植物多糖、動物多糖和微生物多糖[8]。隨著工業的發展，多糖被廣泛應用于食品[9]、醫藥[10]、材料領域[11]。近年來，多糖成了新的研究熱點，主要集中在多糖提取[12]、分離純化[13]、結構分析[14]、抗氧化[15]、免疫活性[16]等方面研究。多糖提取是基于相似相溶原理將多糖從生物體里分離出來的過程。多糖提取方法主要有溶劑提取[17]、超聲波輔助提取[18]、酶解、酸堿提取等方法，但這些提取方法較單一，存在提取率低、耗時長等缺點。超聲-微波協同提取技術是利用微波的電磁能結合超聲波的機械振蕩效果，可大幅度縮短提取時間，節約能源并提高得率，目前已經得到廣泛的應用。如梁茜茜[19]采用超聲微波協同提取燕麥麩皮多糖，與傳統水提法相比，燕麥麩多糖得率從4.3%提高到8.45%；王勝男等[20]采用超聲-微波協同提取大豆種皮多糖性質及微觀結構；蔣新龍等[21]采用超聲波-微波協同提取棠梨籽油。

本試驗采用超聲-微波協同提取柚子皮多糖，通過響應面優化最佳提取工藝條件，并對其單糖組成、結構和抗氧化活性進行研究分析，為柚子皮多糖進一步純化、結構鑒定、活性研究及綜合開發利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柚子：2019年11月15日采購于貴州省荔波縣。

無水乙醇，西隴科學股份公司；NaOH、H2O2，正丁醇，西隴科學股份公司；氯仿，廣州化學試劑廠；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器設備

Waters e2695高效液相色譜儀，美國沃特世公司；TENSOR27傅里葉變換紅外光譜儀、CW-2000型超聲-微波協同萃取儀，上海新拓微波溶樣測試技術有限公司；FDU-2100型冷凍干燥機，埃朗科技國際貿易(上海)有限公司；UV-5500PC紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 超聲-微波協同提取柚子皮多糖單因素及響應面實驗設計

1.3.1.1 多糖提取試驗步驟

多糖提取步驟如下：

柚子皮→烘干→粉碎→過40目篩→稱取10 g柚子皮→超聲微波協同提取→離心(6 000 r/min、10 min)→濃縮(20 mL左右)→醇沉(4倍體積無水乙醇)→靜置(4 ℃下靜置12 h)→離心(6 000 r/min、5 min)→沉淀冷凍干燥→柚子皮多糖

1.3.1.2 多糖得率的計算

多糖得率計算如公式(1)所示：

(1)

式中：m為凍干柚子皮多糖質量，g；M為柚子皮質量，g。

1.3.1.3 多糖提取單因素試驗

試驗探究微波功率(100、200、300、400、500、600 W)、提取液pH(7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)、提取時間(5、10、20、30、40、50 min)、液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1,mL∶g)對柚子皮多糖得率的影響。重復3次平行試驗，取其平均值。固定單因素條件為微波功率300 W、提取時間30 min、提取液pH 9.0、液料比40∶1(mL∶g)。

1.3.1.4 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，選擇影響較顯著的3個單因素:微波功率、提取時間、液料比為響應因子，多糖得率為響應值，采用Design-Expert 8.0.6軟件，通過Box-Behnken實驗設計，進行3因素3水平試驗分析。試驗因素及水平見表1。

表1 實驗自變量因素與水平

1.3.2 柚子皮多糖的脫色、脫蛋白

稱取0.5 g的柚子皮多糖，蒸餾水溶解并定容至200 mL，加入30% H2O210 mL，0.1 mol/L NaOH溶液調節pH至9，在40 ℃下加熱攪拌1 h，6 000 r/min離心5 min[22]。上清液中加入100 mL Sevage試劑[V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1]，劇烈振蕩20 min，移入分液漏斗中靜置20 min，棄去中間與下層物質，重復上述操作4次[23]。脫色脫蛋白后的溶液濃縮，透析48 h除鹽及小分子雜質，每12 h更換一次蒸餾水，凍干即可獲得柚子皮多糖。

1.3.3 紫外光譜分析

取2 mL脫色脫蛋白后的多糖濃縮液，稀釋6倍，0.22 μm微濾膜過濾處理，以水為空白對照，在200～400 nm范圍內紫外光譜掃描，確定多糖樣品特征吸收峰，同時檢測多糖樣品是否存在蛋白質及核酸殘留。

1.3.4 分子質量測定

將柚子皮多糖配制成質量濃度為1 mg/mL的溶液，0.22 μm微濾膜過濾處理。采用凝膠滲透色譜法測定柚子皮多糖分子質量[24]。

1.3.5 單糖組成測定

單糖組成采用1-苯-3-甲-5-吡唑咔柱前衍生化和液相色譜-質譜聯用儀檢測，通過與標準單糖保留時間的比較，確定單糖組成。

(1)多糖水解(多糖中單糖成分)：稱取10 mg多糖樣品于20 mL的鉗口瓶中中,加入5 mL的2 mol/L三氟乙酸,充N2封管(10 L/min，1 min)，100 ℃烘箱中水解2 h；冷卻后打開蓋，取1 mL出來加入1 mL甲醇后，70 ℃水浴下用N2吹干,如此重復加甲醇并用N2吹干2次,以去除三氟乙酸;加入1 mL 0.3 mol/L NaOH溶液充分溶解殘渣，為多糖水解液，一定稀釋后衍生測定。(2)游離單糖的提取：稱取干樣約0.4 g、濕樣1.5 g于具塞刻度管中，加入10 mL乙醇(80%)，在70 ℃水浴超聲提取30 min；10 000 r/min離心，取濾液用80%乙醇定容至10 mL，然后取2 mL加入試管用氮氣吹干，之后加入1 mL NaOH(0.3 mol/L)溶液充分溶解殘渣，分別取400 μL的混合單糖標準液或多糖水解液于5 mL的具塞試管中，加400 μL 1-苯-3-甲-5-吡唑咔甲醇溶液，漩渦混勻；于70 ℃水浴中反應2 h；取出放置冷卻至室溫；加400 μL HCl(0.3 mol/L)中和至pH 6～7;加水1 200 μL，加入等體積的氯仿，渦旋混勻振搖，靜置，棄去氯仿相，如此萃取2次。將水相用0.45 μm微孔膜(水系)過濾后供HPLC進樣分析。

色譜條件：色譜柱AGILENT EC-C18(2.7 μm, 2.1 mm×50 mm)；流動相A：20 mmol/L 乙酸銨緩沖液(pH=7.0)；流動相B：乙腈；流速0.4 mL/min；

質譜掃描條件：特征離子掃描模式；ESI+噴霧電壓2.0 kV；錐孔電壓30 V;離子源溫度150 ℃；脫溶劑溫度500 ℃；脫溶劑氣(N2)1 000 L/h；SIR模式檢測離子：481.09,495.1,510.1,511.08,525.06。

1.3.6 掃描電鏡分析

稱取1 mg柚子皮多糖，粘在粘有導電膠布的載物臺上，用吹塵球吹掉多余樣品，噴金，觀察多糖樣品形態結構。

1.3.7 紅外光譜分析

采用傅里葉變換紅外光譜儀測定多糖的有機官能團。稱取1 mg柚子皮多糖，采用KBr壓片法進行紅外光譜掃描分析[25]。樣品測試前進行背景掃描去除干擾，500～4 000 cm-1范圍內進行空白掃描。

1.3.8 抗氧化活性分析

將柚子皮多糖配制成0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL的多糖溶液，參考ZENG等[26]的方法，測定柚子皮多糖對DPPH自由基的清除率；參考王新等[27]的方法，測定柚子皮多糖對羥自由基的清除率；參考GOPALAKRISHNAN等[28]的方法，測定柚子皮多糖對2,2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS]自由基的清除率；以上實驗均以VC為陽性對照。

2 結果與討論

2.1 柚子皮多糖提取單因素實驗結果

由圖1-A可知，微波功率為100～300 W時，柚子皮多糖得率隨著微波功率的增大而增大，當微波功率為300 W時，多糖得率達到最大。隨著功率的進一步增大，多糖得率呈現下降趨勢，原因可能是超聲波本身具有一定的空化作用，空化作用會產生高溫高壓，這時微波功率過高會引起壓力過大，破壞多糖結構，同時微波功率過高會使溶劑溫度迅速上升，溶劑發生揮發，導致多糖不能充分的溶于溶劑中，出現得率降低[29-30]。試驗微波功率選擇為300 W。

A-微波功率;B-提取液pH;C-提取時間;D-液料比

由圖1-B可知，提取液pH在7.5～9.0時，多糖得率隨著pH的增大而增大，在pH 9.0時，多糖得率達到最大，隨后呈現平緩狀態。試驗提取液pH選擇為9.0。

由圖1-C可知，提取時間在10～30 min時，多糖得率隨著時間的延長而增大；時間在30～50 min時，多糖得率出現輕微增大，隨后呈下降趨勢，原因可能是長時間在高溫高壓狀態下，少部分多糖出現降解。其次隨著時間延長提取液黏度增大，導致多糖溶出受黏度影響溶出速度減慢[31]。試驗提取時間選擇30 min。

由圖1-D可知，液料比在10∶1～40∶1 (mL∶g)時，多糖得率隨著液料比增大而增大，在液料比為40∶1時，多糖得率達到最大。隨著液料比的進一步增大，多糖得率出現輕微下降。原因可能是溶劑的增加導致溶液離心次數增加，增加了多糖的掛壁幾率，出現損耗增加，從而影響多糖得率。試驗液料比選擇為40∶1 (mL∶g)。

2.2 響應面優化試驗結果

2.2.1 回歸模型的建立和方差分析

在柚子皮多糖提取單因素實驗基礎上，選擇影響較顯著的單因素：微波功率、提取時間、液料比為響應因子，多糖得率為響應值，采用Design-Expert 8.0.6軟件對表2、表3中的試驗結果進行響應曲面分析，得到回歸方程：

Y=10.29+0.10A+0.26B-0.28C+0.21AB+0.087AC-0.070BC-0.078A2-0.56B2-0.97C2

表2 超聲-微波協同提取柚子皮多糖工藝優化響應面試驗結果與分析

根據實驗結果進行方差分析，由表3可知，該模型中F值為97.52，P<0.000 1，達到極顯著水平。失擬項的P>0.05，失擬項差異不顯著，表明該回歸方程對試驗擬合程度較好。對回歸方程的顯著性進行檢驗分析表明，超聲-微波協同提取柚子皮多糖工藝條件中微波功率A、提取時間B、液料比C及二次項B2、C2分別對柚子皮多糖得率影響顯著；交互項AB對柚子皮多糖得率影響較顯著(P<0.01)。結果表明，模型回歸系數R2=0.992 1，校正決定系數R2=0.981 9。因此該模型對超聲-微波協同提取柚子皮多糖得率的分析和預測是可靠的。

表3 回歸方程方差分析及結果

2.2.2 響應面分析及優化

響應面圖是運用圖形技術將函數關系顯示出來，便于直接觀察各個變量試驗值與響應值之間的關系以及兩兩變量間的交互作用。由圖2可以看出，各因素交互作用對柚子皮多糖得率的影響。響應面值Y隨著各因素的增加先達到最高點再逐漸減小，若曲線越陡峭，表明響應值對于操作條件的改變越敏感，此因素的交互作用對柚子皮多糖得率的影響越大;反之曲面坡度越平緩，操作條件的改變對響應值的影響就越小。由圖2可知提取時間和液料比對柚子皮多糖得率的影響最大，表3回歸分析結果也與此相吻合，提取時間和液料比的P<0.000 1，均達到極顯著水平。由回歸方程中得到超聲-微波協同提取柚子皮多糖的最佳工藝條件為：微波功率400 W、提取時間34.32 min、液料比38.82∶1 (mL∶g)，在此條件下理論最大得率為10.43%。

2.2.3 驗證試驗

根據操作可行性調整為：微波功率400 W，提取時間34 min，液料比39∶1 (mL∶g)。進行3次重復試驗，測得實際得率為10.41%。實際值與理論值較為接近。表明該回歸模型能夠很好地反映微波功率、提取時間、液料比對柚子皮多糖得率的影響，證明了該方法研究超聲-微波協同提取柚子皮多糖的可行性。此試驗結果比許其亮[6]柚子皮多糖提取得率較高，其多糖得率提高了2.11%，比較明顯的優點是本試驗很大程度地縮短了提取時間、增加了多糖得率。

A-提取時間與微波功率交互作用；B-液料比與微波功率交互作用；C-液料比與提取時間交互作用

2.3 柚子皮多糖的脫色、脫蛋白

柚子皮多糖經30%H2O2脫色，Sevage法脫蛋白，得到澄清透明多糖溶液，濃縮、透析、凍干得柚子皮多糖。

2.4 紫外光譜分析

由圖3可知，柚子皮多糖在200 nm附近有顯著的紫外吸收，表明柚子皮多糖在200 nm附近件有吸收峰，而在260 nm、280 nm處無明顯吸收峰，表明不存在蛋白質及核酸殘留，是一種較純的多糖[32]。

圖3 柚子皮多糖紫外吸收光譜圖

2.5 柚子皮多糖的分子質量測定

分子質量是多糖的重要結構指標，影響多糖的理化和生物學性質。采用凝膠滲透色譜法對柚子皮多糖分子質量進行檢測，測試數據表明，柚子皮多糖平均分子質量為2.4×104Da。

2.6 單糖組成分析

采用液相色譜-質譜聯用方法，通過與標準單糖保留時間的比較分析確定單糖組成。柚子皮多糖單糖組成結果如表4、圖4所示。由圖4、表4可知，柚子皮多糖是一種酸性雜多糖，由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，摩爾比為0.502∶0.960∶0.295∶6.331∶40.673∶10.732∶7.923，其中葡萄糖含量最高。

表4 柚子皮多糖的單糖組成

A-混合標準品;B-柚子皮多糖

2.7 掃描電鏡分析

柚子皮多糖的微觀結構見圖5。由圖5可見，柚子皮多糖主要為不規則碎片結構，伴有小的不規則顆粒，碎片表面粗糙，呈片狀，結構緊密，相互緊靠。所得多糖呈不規則形狀，表明柚子皮多糖具有非晶態結構。掃描電鏡圖表明，在超聲-微波協同提取情況下，柚子皮多糖結構保持完整。

2.8 紅外光譜分析

紅外光譜圖在多糖結構分析方面主要用于官能團的確定、吡喃糖和呋喃糖的區別，以及主要取代基的鑒定等。根據紅外光譜圖的特征峰的出峰位置和形狀可以推測多糖結構的一些特征[16]。由圖6可知，柚子皮多糖在4 000～500 cm-1區有多糖類物質的一般特征吸收。在3 422 cm-1處出現的寬而強的吸收峰是—OH的O—H伸縮振動吸收峰[33]；在2 926 cm-1左右的吸收峰是由于CH3或CH2的弱C—H鍵的伸縮振動所致[34]；在1 619 cm-1處的弱吸收峰為結合水的多糖水合振動吸收峰；1 419 cm-1處的弱吸收峰為烷基的C—H變角度振動吸收峰；1 074 cm-1處的弱吸收峰為吡喃糖苷環骨架的C—O可變角度振動吸收峰，說明分子中存在C—O—H和C—O—C結構[35]；在772 cm-1處出現的微弱吸收峰推測其含有吡喃糖環結構[36]。

圖6 柚子皮多糖的紅外吸收光譜圖

2.9 抗氧化活性分析

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基是為數不多的穩定的有機氮自由基之一，它可以接受電子或氫自由基成為穩定的分子[37]。清除穩定DPPH自由基的模型被廣泛用于評估天然化合物的自由基清除能力[38]。由圖7可知，柚子皮多糖對DPPH自由基、羥自由基、ABTS自由基的清除能力具有劑量依賴關系，隨著柚子皮多糖質量濃度的增大而逐漸增大。其中，柚子皮多糖對DPPH自由基、羥自由基、ABTS自由基半抑制濃度IC50分別為0.34、1.57、1.86 mg/mL；VC對DPPH自由基、羥自由基、ABTS自由基的半抑制濃度IC50分別為0.11、0.12、0.10 mg/mL。圖7-A中，DPPH自由基清除率在柚子皮多糖質量濃度為0.0～0.4 mg/mL時明顯上升，當多糖質量濃度為1.0 mg/mL時，清除率達到最大值55.58%，而標準品VC對DPPH自由基的清除率高達92.60%。

A-DPPH自由基；B-羥自由基；C-ABTS自由基

羥自由基是一種反應性極強的化學分子，在各種自由基物種中具有最強的損傷作用，能很容易地穿過細胞膜，與多種生物分子發生反應，導致組織損傷或細胞死亡，是造成氧化傷害的主要原因。一般來說，在這3種活性氧分子中，DPPH自由基和ABTS自由基是室溫下穩定的自由基，而羥自由基被認為是最具活性的自由基。羥自由基也被認為是最有害的自由基，因此，清除羥自由基對保護生命系統非常重要[39]。如圖7-B所示，在質量濃度達到0.6 mg/mL后，增長趨勢較為平緩，在1 mg/mL時標準品VC對羥自由基的清除率高達92.35%，柚子皮多糖對羥自由基清除率達到最大值46.32%。在植物多糖清除羥自由基實驗中，濃度為21.1 mg/mL的槐根多糖清除羥自由基的活性為74.02%[39]，2.5 mg/mL鐵皮石斛多糖清除羥自由基的活性為75.34%[14]，0.3 mg/mL苦瓜多糖清除羥自由基的活性為63.92%[40]，均表明植物多糖具有開發作為天然抗氧化劑的前景。

ABTS自由基測定法也是一種快速評估多糖抗氧化能力的方法，多糖可向不穩定的ABTS陽離子自由基提供一個電子和氫原子以形成穩定的ABTS自由基，且在734 nm處可檢測到藍綠色ABTS自由基溶液的顏色還原[41]。如圖7-C所示，在質量濃度0.8 mg/mL的柚子皮多糖中，清除ABTS自由基的活性最大值為40.25%。標準品VC對羥自由基的清除率達98.70%。可見，柚子皮多糖對DPPH自由基的清除能力均強于對羥自由基和ABTS自由基的清除能力。其清除自由基能力的差異可能是由于其特殊的結構，其抗氧化機理與多糖結構的關系尚需進一步研究。

3 結論

超聲-微波協同提取柚子皮多糖，在單因素試驗基礎上，利用響應面優化最佳工藝為：微波功率400 W，提取時間34 min，液料比39∶1(mL∶g)，提取液pH 9.0，多糖得率為10.41%。柚子皮多糖平均分子質量為2.4×104Da，由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成的酸性雜多糖，摩爾比為0.502∶0.960∶0.295∶6.331∶40.673∶10.732∶7.923，主要為不規則碎片結構，伴有小的不規則顆粒，碎片表面粗糙，所得多糖呈不規則形狀，表明柚子皮多糖具有非晶態結構，為吡喃型糖苷環骨架，具有較好的自由基清除能力，對DPPH自由基、羥自由基和ABTS自由基的半抑制濃度IC50分別為0.34、1.57、1.86 mg/mL。