二重環介導等溫擴增法快速檢測乳粉中沙門氏菌和金黃色葡萄球菌

徐文文，梁玉林，王云霞，劉秀*，尹建軍，周廣軍，宋全厚，丁夢璇，周鵬飛

1(中國食品發酵工業研究院有限公司，北京，100015)2(內蒙古伊利實業集團股份有限公司，內蒙古 呼和浩特，010110)3(山東稻香村食品工業有限公司，山東 菏澤，274100)

乳制品在食品行業中占據不可忽視的地位。據中國奶業質量報告數據顯示，2011—2016年，我國每年以87.1萬t的增長趨勢，完成全國乳制品消耗量從2 480.5到3 204.7萬t的飛越[1]；2018—2019年乳制品行業趨于穩定，但全國每年總消耗量也均為2 400萬t以上，巨大的消耗在推動乳業經濟發展的同時，對乳制品質量安全提出考驗。根據國家食品安全標準，沙門氏菌和金黃色葡萄球菌被列為乳粉中重點關注的食源性致病菌[2-3]。沙門氏菌屬腸道細菌科，其通過多種毒力因子作用于人體引起腸道炎、敗血癥，在我國已報道的細菌性食物中毒事件中沙門氏菌占比70%以上[4]，在全球沙門氏菌也穩居前列。金黃色葡萄球菌是世界范圍內另一大食源性致病菌，主要通過腸毒素污染食物引起食物中毒，2000年，日本雪印乳品公司的牛奶中毒事件就是由金黃色葡萄球菌感染造成，先后涉及8個縣，14 780人中毒[5]。沙門氏菌和金黃色葡萄球菌引起的乳品污染危害不容小覷。

目前沙門氏菌和金黃色葡萄球菌檢測多采用傳統培養法或聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction， PCR)方法[6-7]。前者通過菌落形態特征及其生理生化特性進行菌種鑒定，工作繁瑣且耗時較長，檢測結果往往滯后于生產，無法及時為企業提供風險預警；后者雖有效提高了檢測效率，但對實驗人員和儀器精密度要求高，難以在車間得到有效開展。環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一種依托核酸進行目標物體識別的一種新技術，該技術通過4條或6條引物，在等溫條件下進行核酸擴增。與其他方法相比，LAMP技術極大減少了對儀器精密度的要求，檢測耗時短且靈敏度高，被廣泛應用于各類微生物檢測[8-13]。但現有的LAMP方法大多只能針對一種菌種進行檢測，當樣品中同時存在多種微生物時只能分批進行定性檢測，工作量較大。本研究分別利用沙門氏菌invA侵襲蛋白A基因[14-16]和金黃色葡萄球菌nuc耐熱核酸酶基因[17-18]設計合成引物，優化引物濃度并對擴增產物進行熔解曲線分析，建立二重LAMP檢測體系，旨在為乳制品尤其是乳粉中的沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的篩查鑒定提供一種快速、有效的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 菌株

實驗共涉及15株菌株，包括3株沙門氏菌、3株金黃色葡萄球菌及另外9株非目標常見食源性致病菌，具體菌株信息見表1。

表1 菌株信息

1.2 儀器與設備

G49194G微量移液器、5804R、5424型離心機，德國Eppendorf公司；SX-700高壓滅菌鍋，日本Tomy Digital Biology公司；CPA323S精密天平，德國Sartorius公司；VORTEX-5渦旋儀，Kylin-bell公司；AC2-4S1生物安全柜，新加坡Esco公司；Biodrop超微量核酸蛋白分析儀，英國柏點公司；Genie Ⅱ溫擴增熒光檢測儀，英國OptiGene Limited公司。

1.3 試劑

腦心浸液肉湯(brain heart infusion broth, BHI)，平板計數瓊脂(plate count agar, PCA)，北京路橋技術股份有限公司；細菌DNA提取試劑盒、無菌雙蒸水，天根生化科技有限公司；Isothermal Master Mix(IMM)，英國OptiGene Limited公司；LAMP擴增引物，英濰捷基(上海)貿易有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種培養及DNA模板制備

將表1中沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等15株細菌分別接種于10 mL腦心浸液肉湯中，36 ℃、180 r/min搖床培養12小時，離心收集菌體。以滅菌生理鹽水對所得菌體進行重懸，充分混勻制成菌懸液，并按照細菌DNA提取試劑盒操作步驟提取基因組DNA，-20 ℃冰箱保存備用。

1.4.2 引物設計與合成

以沙門氏菌invA基因，金黃色葡萄球菌nuc基因作為引物設計靶基因，利用引物設計軟件Primer Explorer(primerexplorer.jb/lampv5e/index.html)進行LAMP引物設計。具體引物信息如表2，引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。

表2 沙門氏菌和金黃色葡萄球菌LAMP引物序列

1.4.3 單重LAMP體系的建立與二重LAMP體系的優化

12.5 μL沙門氏菌和金黃色葡萄球菌單重LAMP反應體系包括7.5 μL IMM、3.5 μL引物(2.5 pmol F3和B3，20 pmol FIP和BIP，10 pmol LF和LB)及1.5 μL核酸模板，擴增溫度為65 ℃，擴增時間為30 min。

為了保證沙門氏菌和金黃色葡萄球菌擴增效率一致，對影響較大的引物濃度進行優化。分別在各自原混合引物濃度(5.2 μmol/L)的基礎上，調整每種引物混合液所占二重引物混合液的體積份額改變引物濃度，引物濃度比設定為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4。

1.4.4 特異性實驗驗證

應用6株目標菌株和9株其他常見食源性致病菌菌株核酸，在Genie Ⅱ等溫擴增熒光檢測儀上分別測試單重、二重LAMP反應體系，并以熒光積累擴增曲線觀察擴增結果，驗證檢測方法特異性。

1.4.5 熔解曲線的分析

分別以單一沙門氏菌和金黃色葡萄球菌核酸為模板，進行LAMP擴增檢測并對所得產物的熔解曲線進行分析，確定沙門氏菌和金黃色葡萄球菌擴增產物的熔解曲線特征峰。同時，觀察混合菌株核酸同時檢測時，擴增產物熔解曲線的退火溫度與單一菌株擴增熔解曲線的退火溫度是否一致。

1.4.6 單一菌株檢測靈敏度

以沙門氏菌和金黃色葡萄球菌核酸為模板，進行10倍梯度稀釋，使核酸終質量濃度為100fg/μL～100ng/μL。采用LAMP方法分別對2種食源性致病菌各濃度核酸進行檢測，每個梯度重復10次實驗，把10次全部檢出的最低梯度定為最低檢測靈敏度。實驗以無菌雙蒸水作為陰性對照。

1.4.7 混合菌間擴增干擾測試

固定沙門氏菌核酸質量濃度為100 pg/μL，金黃色葡萄球菌核酸分別與之按照1∶1、1∶50、1∶100、1∶150濃度比混合形成混合核酸模板；再將金黃色葡萄球菌核酸質量濃度固定為100 pg/μL，沙門氏菌核酸分別與之按照1∶1、1∶50、1∶100、1∶150混合形成混合核酸模板，分別進行10次二重LAMP擴增檢測，并對產生的熔解曲線進行分析，以此測試混合菌濃度未知情況下，高濃度核酸對低濃度核酸擴增干擾程度。

1.4.8 脫脂乳粉樣品檢測及與國標法的比較

將沙門氏菌、金黃色葡萄球菌分別接種于營養培養基中，36 ℃培養12 h后，以脫脂乳粉作為基質制備人工污染樣品，每個樣品制作10份，其中3份作為陰性對照，7份加入100CFU/mL的待檢測菌液(實際菌量通過培養法進行計數獲得)作為污染樣品。為保證檢測結果的準確性，實驗前經國標方法驗證所用脫脂乳粉中不含任何病原菌。

將每份樣品分別采用2種方法進行檢測，其中國家標準GB 4789.4—2016、GB 4789.10—2016作為LAMP方法的基準；LAMP法按照國標法進行預增菌后，取1 mL進行DNA提取和擴增檢測，探討該方法的實用性及可靠性。

2 結果與分析

2.1 二重LAMP體系引物濃度配比

不同濃度配比的二重LAMP體系對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的擴增檢測結果如圖1所示。由結果可知沙門氏菌∶金黃色葡萄球菌引物濃度比為 3∶1時，同濃度核酸擴增效率相對一致，均可在7.5 min產生熒光擴增曲線，因此確定沙門氏菌∶金黃色葡萄球菌最佳引物濃度比為3∶1。

a-沙門氏菌∶金黃色葡萄球菌1∶1;b-沙門氏菌∶金黃色葡萄球菌2∶1;c-沙門氏菌∶金黃色葡萄球菌3∶1;d-沙門氏菌∶金黃色葡萄球菌4∶1

2.2 特異性驗證

對設計的引物進行特異性驗證，結果如表3所示。單重LAMP體系及二重LAMP體系均只特異性擴增沙門氏菌和金黃色葡萄球菌，而對其他非目標菌株無擴增，表明建立的方法對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA具有良好特異性。

2.3 LAMP擴增熔解曲線分析

對單重沙門氏菌、金黃色葡萄球菌擴增熔解曲線進行分析，結果如圖2所示。單一沙門氏菌的熔解曲線在85～90 ℃出現，特征峰在88 ℃產生；單一金黃色葡萄球菌的熔解曲線在80～84 ℃出現，特征峰在83 ℃產生。對等濃度混合基因組核酸進行擴增，結果擴增產物分別在85～90 ℃和80～84 ℃各有一個熔解曲線特征峰，與單重熔解曲線特征峰退火溫度范圍一致，表明建立的二重LAMP擴增方法可實現沙門氏菌和金黃色葡萄球菌同時檢測。此外，根據不同特征峰退火溫度，也可直接判斷菌株信息，完成菌株定性區分鑒定。

2.4 單一菌檢測靈敏度

分別對不同濃度梯度沙門氏菌和金黃色葡萄球菌核酸進行LAMP法檢測，結果如圖3所示。陰性對照及核酸質量濃度為100fg/μL時，沙門氏菌和金黃色葡萄球菌樣品均無擴增曲線，≥101fg/μL時有擴增曲線。對產生擴增曲線的核酸濃度進行10次重復實驗，把10次全部檢出的最低梯度定為最低檢測靈敏度。結果表明，當核酸質量濃度為101fg/μL時，10次LAMP重復試驗有2、3次未檢出；核酸質量濃度≥102fg/μL時，10次重復試驗全部檢出，因此規定本實驗建立的二重LAMP檢測方法對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌最低穩定檢測靈敏度為102fg/μL。

表3 LAMP特異性熒光曲線擴增結果

2.5 混合菌間擴增干擾測試

對不同濃度配比的沙門氏菌和金黃色葡萄球菌混合基因組核酸進行擴增，結果如圖4。當沙門氏菌與金黃色葡萄球菌核酸濃度比為1∶1時，沙門氏菌和金黃色葡萄球菌在85～90 ℃和80～84 ℃均有明顯的熔解曲線，隨著沙門氏菌核酸體積比減少，沙門氏菌特征峰熒光值漸漸降低，當濃度比為1∶150時，85～90 ℃已不能觀察到對應沙門氏菌的熔解曲線，反之亦然。證明進行混合菌檢測時，2種菌液核酸濃度比不能超過100倍，一旦超過100倍時，高濃度核酸熔解曲線會掩蓋低濃度核酸熔解曲線的出現，影響目標菌株的定性鑒定。

a-沙門氏菌熔解曲線;b-金黃色葡萄球菌熔解曲線;c-混合菌熔解曲線

a-沙門氏菌檢測靈敏度;b-金黃色葡萄球菌檢測靈敏度

a-沙門氏菌∶金黃色葡萄球菌熔解曲線;b-金黃色葡萄球菌∶沙門氏菌熔解曲線

2.6 脫脂乳粉樣品檢測及與國標法的比較

制備30個脫脂乳粉樣品，預增菌培養后分別進行LAMP法檢測和國標法檢測。結果如表4所示，100CFU/mL濃度的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌污染樣品，經36 ℃增菌12 h，LAMP檢出結果和國標法檢出結果完全一致，未出現假陽性和假陰性結果，說明該方法具有良好的穩定性和準確性。此外，從預增菌到獲得檢測結果，全過程可在1 d內完成，大大縮短了國標法檢測周期，更省時便捷。

表4 脫脂乳粉樣品檢測結果

3 討論與結論

沙門氏菌和金黃色葡萄球菌已成為全球關注的食源性致病菌，每年感染人數達千萬人，死亡病例達上萬例，是我國乳粉出廠必檢項目[19-21]。通常被沙門氏菌和金黃色葡萄球菌污染的乳粉外觀和氣味沒有明顯異常，消費者難以通過感官品評判斷產品污染，一旦被群眾食用，將對消費者和廠家造成嚴重的健康危害和經濟損失，因此對這2種食源性致病菌的實時檢測非常必要[22-23]。實驗依據前人研究成果，選擇沙門氏菌特有侵襲蛋白invA基因和金黃色葡萄球菌特有耐熱核酸酶nuc基因進行引物設計。同時，由于不同引物本身對核酸擴增效率不同，為避免低效率擴增菌種漏檢風險，保證實際檢測結果準確性，對二重引物配比進行調整。結果，沙門氏菌∶金黃色葡萄球菌引物濃度比為3∶1時，建立的二重檢測方法效率最佳。對6株目標菌株和9株非目標菌株分別進行單獨和混合檢測，對應的沙門氏菌和金黃色葡萄球菌核酸均能得到特異性擴增，而其他非目標菌的菌液核酸均未產生擴增，證明引物擴增具有良好的特異性和穩定性。

現階段應用LAMP方法對微生物的定性檢測多集中在單一菌種的檢測，主要原因在于LAMP引物數量多，單個目標菌的檢測已達到4條或者6條引物，多重引物更會翻倍增加，引物間堿基互補配對的不確定性為LAMP多重體系的構建帶來了難度。TANNE等[24]和XIA[25]等也對多重體系進行了研究，但多數僅能用于菌種快速篩查，而不能對幾種菌進行同時定性鑒定。本實驗采用熔解曲線法對二重LAMP擴增產物進行分析，通過觀察熔解曲線、特征峰的退火溫度，直接對檢測菌種進行區分判定，直觀簡單，保證了2種菌種同時快速篩查和定性鑒定需求。

在單一菌種靈敏度檢測實驗中沙門氏菌、金黃色葡萄球菌靈敏度均達到102fg/μL，與文獻報道PCR法比較，檢測靈敏度提高了10～100倍[26]，檢測結果較理想。對混合菌間擴增干擾測試中設置了1∶1、1∶50、1∶100、1∶150四個濃度梯度，擬驗證實際樣品菌濃度不定情況下的檢出限制。結果發現，當沙門氏菌和金黃色葡萄球菌濃度比相差100倍以上時，低濃度菌種核酸會被高濃度菌種核酸掩蓋，使其無法產生對應熔解曲線，低濃度目標菌株產生假陰性結果，也是實驗存在的一個局限，但乳粉中沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測本身就是一種低濃度污染樣品檢測，因此實際應用中，結果局限性實現可能不大。

綜上所述，本實驗以沙門氏菌侵襲蛋白invA基因和金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶nuc基因設計建立的二重環介導等溫擴增方法特異性強、靈敏度高，實施性好，為乳粉企業沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的風險評估提供方向，應用前景廣闊。