高產酯化酶細菌的復合誘變選育及固態發酵條件優化

趙志軍，張艷珠,3，劉延波，周平平，葛少華，孫西玉*

1(河南牧業經濟學院 酒業學院，河南 鄭州，450046)2(寶豐酒業有限公司，河南 平頂山，467500)3(寧波大學 食品與藥學學院，浙江 寧波，315211)

中國白酒作為全球消費量最大的蒸餾酒[1]，是以糧谷為主要原料，在酒曲等糖化發酵劑的作用下，經蒸煮、糖化、發酵、蒸餾而成[2]。白酒的發酵是多種微生物協同作用的結果[3]，微生物代謝產生種類繁多的微量有機化合物構成了白酒獨特的“香和味”[4-6]。白酒中含有約2%的呈香呈味物質決定著酒體的品質[7]。其中酯類的含量最為豐富，其含量高低是影響白酒質量和風格的主要因素[8-9]。通常來說，優質白酒中的酯含量也相對較高。

酯化酶亦稱為羧基酯酶，是微生物產酯過程中的關鍵酶，能夠催化低級脂肪酸酯的合成[10]。產酯微生物的產酯化酶能力提升，能夠增加白酒中酯類的含量進而提升白酒品質[11]。因此，篩選高產酯化酶微生物并強化其產酶能力，對白酒的生產及質量的提高具有非常重要的意義。謝軍等[12]從酒曲中篩選得到具備酯化力的酵母菌和霉菌。田宇敏[13]從清香型白酒酒醅中分離得到產香的白地霉。單淑芳等[14]篩選出酯化力較強的紅曲霉。趙志軍等[15]從窖泥中篩選得到酯化型細菌。諸多產酯微生物的獲得，為其在白酒生產中的應用奠定了基礎。

理化誘變是一種獲得優良菌種的有效方式[16]。紫外線(ultraviolet，UV)誘變具有操作簡便，效果好、安全性高的特點[17-18]，是微生物誘變育種中較為常用的手段。硫酸二乙酯(diethyl sulfate，DES)是一種烷化誘變劑，常用于高產優質菌株的選育，效果顯著[19-20]。復合誘變是將兩種及兩種以上的誘變方法結合使用，形成誘變互補優勢，與單因素誘變相比效果更好。SONG等[21]通過高能碳重離子輻照和NaNO2聯合處理，獲得了1株高產阿維菌素B1a的突變體。劉文龍等[22]采用UV-等離子體復合誘變選育出了高產酸性蛋白酶菌株；劉剛等[23]通過UV-DES復合誘變篩選出了高產胞外多糖突變株。以上研究均表明利用復合誘變技術，使得菌株原有有益性狀得到較大幅度的提升。

目前，對產酯化酶微生物的研究以酵母和霉菌居多，細菌的研究較少，對產酯化酶細菌的復合誘變選育未見報道。本研究以先期篩選獲得的貝萊斯芽胞桿菌(Bacillusvelezensis)為出發菌株，對其進行UV-DES復合誘變選育，獲得高產酯化酶菌株，并進行固態發酵條件優化。該研究有望獲得高產酯化酶細菌菌株，為提高白酒優質酒出產率提供有價值的可參考信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

貝萊斯芽胞桿菌(B.velezensis)Nz 1.201[15],由河南牧業經濟學院白酒風格工程技術中心分離并保藏。

1.1.2 試劑

生化試劑牛肉膏、蛋白胨,北京奧博星生物技術有限責任公司；生化試劑瓊脂粉,北京索萊寶科技有限公司；分析純無水乙醇、葡萄糖、NaOH,天津市科密歐化學試劑有限公司；三丁酸甘油酯、色譜純硫酸二乙酯(分析純),上海麥克林生化科技有限公司；聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA),上海臣啟化工科技有限公司；HCl(分析純),南京化學試劑股份有限公司。

1.1.3 培養基

液體培養基(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，調pH至5.0。

固體培養基(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，瓊脂粉20，調pH至5.0。

種子培養基(g/L)：牛肉膏20.0，葡萄糖20.0，NaCl 0.5，K2HPO41.0，(NH4)2SO41.0，SO4·7H2O 1.0，FeSO4·7H2O 0.01，調pH至5.0。

初篩培養基：細菌液體培養基與乳化液按體積比9∶1混合，瓊脂粉20 g/L，并充分混勻；

固態發酵培養基：250 mL三角瓶中裝入含水量調整為60%(質量分數)的麩皮100 g。

以上培養基的滅菌條件均為121 ℃、0.1 MPa高壓滅菌30 min。

PVA溶液：稱取3 g PVA于100 mL蒸餾水中，邊加熱邊攪拌，使其完全溶解，并用無菌紗布過濾。

乳化液：PVA溶液和三丁酸甘油酯按體積比9∶1混合，并充分搖勻。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2F型超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；DNP-9272BS恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；ZQLY-300S恒溫培養搖床，上海精宏試驗設備有限公司；H1850R臺式冷凍高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；DHG-9143BS電熱鼓風干燥箱，上海新苗醫療器械制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 初始菌株酯化酶酶活力測定

取出-20 ℃保藏的菌株Nz 1.201，接種于試管斜面固體培養基上，30 ℃條件下培養48 h，使其活化。將活化后菌種，接種到種子培養基中，在30 ℃、150 r/min條件下搖床培養48 h。按3%的接種量，將種子液接入到固態發酵培養基中，置于30 ℃的培養箱中，每隔24 h搖瓶一次，培養6 d，即為麩曲。將其倒于已滅菌的牛皮紙上，置于干燥箱中30 ℃烘干，密封保存。

酯化酶酶活力測定：參考QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》中酯化力的測定方法[24]。

酯化酶酶活力定義為：每100 g大曲在35 ℃，經過7 d催化，己酸和乙醇合成己酸乙酯的毫克數為1個酶活力單位(U/100g)。

1.3.2 復合誘變及篩選

對出發菌株進行UV誘變，篩選出酶活力最高的菌株，之后進行DES誘變，并從中篩選出酶活力進一步提高的突變株，隨即進行遺傳性能檢測。

1.3.2.1 UV誘變及篩選

挑取斜面培養基上的出發菌株，接種到含有100 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，150 r/min、30 ℃條件下培養36 h至對數期中期，制備成菌懸液。

取菌懸液5 mL置于滅菌的直徑9 cm培養皿中，置于UV誘變燈正下方50 cm處，打開皿蓋，準確記時，處理時間分別為0、0.5、1、2、3、4、5 min。對每個處理樣品均進行梯度稀釋，取0.1 mL稀釋液涂布培養基平板，30 ℃倒置暗培養3 d，觀察記錄。統計菌落，計算致死率，選擇致死率為70%～90%作為UV最佳照射時長[25]，計算如公式(1)所示：

(1)

根據最佳UV照射時長對出發菌株進行UV誘變，之后進行系列稀釋、涂布，并于30 ℃培養箱中倒置暗培養3 d，觀察記錄。

從平板上挑取長勢良好的菌株，點接種于初篩培養基，30 ℃培養3 d后，觀察菌落周圍的透明圈，記錄透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)之比HC值。選取HC值大的菌株進行固態發酵，測定其酯化酶酶活力，具體方法同1.3.1。

1.3.2.2 DES誘變及篩選

將UV誘變獲得的菌株制備成菌懸液。各取10 mL，分別加入一定量的DES，形成DES含量為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μL/mL的6個誘變濃度梯度，以不加DES為空白對照。在30 ℃、150 r/min條件下搖床振蕩30 min，然后加入1 mL 20 g/L Na2S2O3終止誘變反應[26]。將處理后的菌懸液稀釋涂布，30 ℃下培養3 d，統計菌落數，計算致死率。選擇致死率為80%～90%為DES最佳誘變劑量，致死率計算如公式(2)所示：

(2)

選取最佳DES誘變劑量對菌懸液進行誘變，按1.3.2.1方法對突變株進行篩選。

1.3.2.3 遺傳穩定性測定

對復合誘變獲得的酯化酶酶活力顯著提高的突變株進行連續傳代5次培養，測定其酶活力，以確定突變菌株的遺傳穩定性。

1.3.3 固態發酵條件優化

1.3.3.1 單因素試驗

對培養溫度、培養時間、接種量、原料含水量進行單因素試驗，因素水平設計具體見表1。

表1 單因素水平設計表

1.3.3.2 酯化酶酶活力測定

進行酯化酶酶活力測定，具體方法同1.3.1。

1.3.3.3 響應面優化固態發酵條件

根據單因素試驗的結果，選擇對菌株酯化酶酶活力影響較大的3個因素作為自變量，以酶活力為響應值(Y)，利用Design-Expert軟件設計Box-Behnken試驗，確定最優固態發酵條件并對其進行驗證。

2 結果與分析

2.1 初始菌株酯化酶酶活力測定

對菌株Nz 1.201進行酯化酶酶活力測定，測得其酶活力為37.70 U/100g。

2.2 復合誘變及篩選

2.2.1 UV誘變結果

對出發菌株進行UV照射，測定不同照射時長菌株的致死率，結果見圖1。在一段時間內，隨著UV照射時間的延長，菌株的致死率急劇增大，當照射時間為3 min時，菌株致死率約為82%，此時正突變率最大，以此作為UV誘變最佳照射時間。

圖1 UV照射時間對菌體致死率的影響

2.2.2 UV誘變篩選

以UV照射3 min對出發菌株Nz 1.201進行處理，之后進行梯度稀釋，涂布初篩培養培養皿上，于30 ℃倒置暗培養3 d。獲得長勢良好的菌株30株，編號為B1～B30，選取HC值大的10株菌株進行固態發酵，并測定其酯化酶酶活力，結果見表2。

表2 UV誘變突變株的HC值及酯化酶酶活力測定

由表2可知，突變株B28酯化酶酶活力最高，達48.52 U/100g，較原始菌株Nz 1.201提高了約29%。

2.2.3 DES誘變

將菌株B28制成菌懸液，測定在不同濃度的DES處理條件下B28的致死率，測定結果見圖2。

圖2 DES含量對菌體致死率的影響

由圖2可知，當DES含量為3 μL/mL時，菌株B28致死率約為89%，以此作為DES處理的最佳濃度。

2.2.4 DES誘變篩選

以DES含量為3 μL/mL對B28進行處理，獲得菌株共計40株，編號為D1～D40，從中挑選出HC值較大的12株菌株進行固態發酵，測定其酯化酶酶活力，結果見表3。

表3 DES誘變突變株的HC值及酯化酶酶活力測定

由表3可知，突變株D27酯化酶酶活力最高，70.90 U/100g，較B28酶活力提高了約46%，較原始菌株Nz 1.201酶活力提高了88%。因此，選取D27作為遺傳穩定性測定及固態發酵條件優化菌株。

2.3 遺傳穩定性測定

將篩選到的突變菌株D27連續傳代培養，對連續培養的5代菌株進行酯化酶酶活力測定，以確定突變菌株的遺傳穩定性，測定結果見圖3。

圖3 突變株的遺傳穩定性測定結果

由圖3可知，在對突變株D27進行第3～5次傳代時，酯化酶酶活力趨于穩定，為62.45 U/100g，較出發菌株酯化酶酶活力提高了66%。由此可知經UV-DES復合誘變得到的突變株D27具有較好的遺傳穩定性。

2.4 單因素試驗

2.4.1 培養溫度對菌株酯化酶酶活力的影響

由圖4可知，菌株D27的酯化酶酶活力隨著培養溫度的升高先增大后減小。培養溫度對菌株影響較大，培養溫度較低時，菌株的生長較慢，酶的分泌量少，酶活力較低；隨著培養溫度的升高，微生物代謝旺盛，酶的分泌量逐漸增加，酶活力增大；在培養溫度為33 ℃時，菌株D27的酯化酶酶活力達到最大值為85.74 U/100g；培養溫度繼續升高，不利于菌株生長，酶產量和積累量減少，酶活力降低。

圖4 不同培養溫度菌株酶活力的影響

2.4.2 培養時間對菌株酯化酶酶活力的影響

培養時間對菌株酯化酶酶活力的影響見圖5。

圖5 不同培養時間對菌株酶活力的影響

由圖5可知，菌株D27的酯化酶酶活力隨著培養時間的增加先增大后減小。培養時間較短時，菌株未能充分生長繁殖，酶的分泌量和積累量較少，酶活力較低；隨著培養時間的延長，酶的分泌量和積累量逐漸增加，酶活力升高；在培養時間為6 d時，菌株D27的酯化酶酶活力達到最大值為88.81 U/100g；培養時間繼續增加，培養基質被大量消耗，菌株進入衰亡期，產酶量逐漸減少，部分酶開始失活，酶活力下降。

2.4.3 接種量對菌株酯化酶酶活力的影響

接種量對菌株酯化酶酶活力的影響結果見圖6。

圖6 不同接種量對菌株酶活力的影響

由圖6可知，菌株D27的酯化酶酶活力隨著接種量的增加先增大后減小。在接種量為3%時，菌株D27的酯化酶酶活力最大為82.27 U/100g；接種量繼續增加，微生物大量生長加快了對基質的消耗，產酶量降低，酶活力急劇下降。

2.4.4 原料含水量對菌株酯化酶酶活力的影響

原料含水量對菌株酯化酶酶活力的影響結果見圖7。

圖7 不同原料含水量對菌株酶活力的影響

由圖7可知，菌株D27的酯化酶酶活力隨著原料含水量的增加先增大后減小。原料含水量過少，抑制微生物的生長代謝，酶的分泌量較少，酶活力較低；隨著含水量的增加，微生物生長代謝增加，酶活力顯著提高；在原料含水量為70%時，菌株D27的酯化酶酶活力最大為88.24 U/100g；繼續增大原料含水量，固態培養基質產生粘黏現象，透氣性較差，不利于微生物的生長代謝及酶活積累，產酶量減少，酶活力降低。

2.5 響應面試驗結果

根據單因素分析結果，選取對菌株酯化酶酶活力影響較大的培養時間、接種量、原料含水量3因素作為自變量，以酯化酶酶活力為響應值(Y)，采用Design Expert軟件設計響應面分析試驗。對數據進行回歸分析，確定最佳固態發酵條件，并設計試驗進行驗證。根據Box-Behnken試驗設計原理，設計試驗因素水平表，見表4。

表4 Box-Behnken 試驗因素與水平

2.5.1 模型方差分析及響應面分析

依據Box-Behnken試驗設計原理，設計17個試驗點的響應面分析試驗，試驗設計與結果見表5所示。

表5 Box-Behnken 試驗設計及結果

采用Design Expert 8.0.6軟件對表5數據進行二次回歸方程擬合，得到菌株酯化酶酶活力對培養時間(A)、接種量(B)及原料含水量(C)的多元二次回歸方程：酯化酶酶活力=88.49-1.23×A-2.03×B+3.52×C+0.18×A×B-4.82×A×C+0.62×B×C-13.33×A2-7.88×B2-3.28×C2具體結果見表6。

表6 響應面試驗回歸模型方差分析

2.5.2 各因素響應面交互作用分析

根據回歸方程繪制響應面分析圖，以確認培養時間、接種量和原料含水量對酯化酶酶活力的影響，響應面曲面和等高線見圖8。

a～b,接種量和培養時間；c～d，原料含水量和培養時間；e～f，接種量和原料含水量

2.5.3 驗證試驗

通過Design Expert 8.0.6軟件分析，培養溫度為33 ℃時，固態發酵最佳條件為培養時間5.67 d、接種量2.90%、原料含水量73.23%，在此條件下酯化酶酶活力的理論值為89.84 U/100g?？紤]到實際操作可行性，在培養溫度為33 ℃時，選擇固態發酵條件為培養時間6 d、接種量3%、原料含水量73%進行驗證試驗。

對突變株D27進行固態發酵驗證，測得優化后的酯化酶酶活力為89.52 U/100g，較出發菌株酶活提升了137%，驗證結果與響應面試驗預測結果基本一致，說明優化條件方案可行。

3 結論

本研究利用UV-DES復合誘變處理產酯化酶菌B.velezensisNz1.201，獲得了酯化酶酶活顯著提高且遺傳性能穩定的突變菌株B.velezensisD27，其酯化酶酶活為62.45 U/100g，比初始菌株提高了66%?；趩我蛩貙嶒灥捻憫鎯灮Y果顯示，該菌株的最佳固態發酵條件為培養溫度33 ℃、培養時間6 d、接種量3%、原料含水量73%。在此條件下，B.velezensisD27的酯化酶活力最高可達89.52 U/100g，較初始菌株酶活提高了137%。綜上所述，本研究獲得了1株高產酯化酶菌株，為產酯化酶細菌的固態培養提供了重要的參考依據，對產酯化酶細菌在白酒生產中提高優質酒出產率領域的研究奠定了基礎。